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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 想请教一下做RACE时，特异性引物的设计问题，以及如何根据同源保守区设计引物？
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zqxy1223

铁虫 (初入文坛)

[求助] 想请教一下做RACE时，特异性引物的设计问题，以及如何根据同源保守区设计引物？

我是一个做分子生物学的新手，老师也没太多时间知道，所以的问题都要靠自己摸索。所以我的问题在您看来若很弱智，请您耐心的解答，非常感谢。
    我想在利用RACE方法做植物上一个基因的全长，根据同源克隆法，利用DNAMAN比对序列后，如何选取保守区，选择保守区序列的位置和原则是什么？又如何根据保守区设计3‘引物和5’引物？还是先做3‘race,根据pcr产物再做5’race?非常感谢。
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1楼 2013-08-22 20:11:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xuzhu598

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-23 11:45:40
首先得NCBI上找到相似物种的cDNA序列，比对下，根据同源保守区（就是物种之间都没有变化的序列）设计两条GSP，两者之间隔个100bp-200bp左右吧！3‘RACE简单点
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3楼2013-08-22 21:33:39
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普通回帖

夏菡小屋

金虫 (正式写手)
同问啊。
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2楼2013-08-22 20:38:55
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zqxy1223

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xuzhu598 at 2013-08-22 21:33:39
首先得NCBI上找到相似物种的cDNA序列，比对下，根据同源保守区（就是物种之间都没有变化的序列）设计两条GSP，两者之间隔个100bp-200bp左右吧！3‘RACE简单点

可是我的这个基因我选取的保守区，设计的引物GC含量都很低，已经设计了多条，都很低，该怎么办？
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4楼2013-08-23 15:23:03
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zqxy1223 at 2013-08-23 15:23:03
可是我的这个基因我选取的保守区，设计的引物GC含量都很低，已经设计了多条，都很低，该怎么办？...

primer长度25-27bp左右吧，GC%有40吗？理论很多时候和实际不一样的，建议你多设计几条！3‘相对来说简单多了，问题应该不大。
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5楼2013-08-23 20:46:26
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fantasist001

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确保每个引物的3‘端都在完全or最保守区。先做3端是正道。
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6楼2013-08-23 21:51:20
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zqxy1223

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuzhu598 at 2013-08-23 20:46:26
primer长度25-27bp左右吧，GC%有40吗？理论很多时候和实际不一样的，建议你多设计几条！3‘相对来说简单多了，问题应该不大。...

在弱弱的问一下，我根据其他物种来寻找保守区，设计引物，是不是应该设计简并引物啊~~
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7楼2013-08-24 10:04:36
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zqxy1223

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fantasist001 at 2013-08-23 21:51:20
确保每个引物的3‘端都在完全or最保守区。先做3端是正道。

因为我没有已知片段，我是不是应该先设计简并引物，P出一段序列，在做3‘端啊？
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8楼2013-08-24 10:05:39
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zqxy1223 at 2013-08-24 10:05:39
因为我没有已知片段，我是不是应该先设计简并引物，P出一段序列，在做3‘端啊？...

不是简并引物，你找几个相似的物种来设计就可以了！
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9楼2013-08-24 22:18:26
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暗星

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得先根据其他物种基因的保守区设计兼并引物，在你做的物种上扩兼并引物之间的序列
然后根据测得本物种的序列设计特异引物，先做3‘
最后做5’
浅显的意见!
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10楼2013-08-25 11:10:19
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