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zqxy1223

铁虫 (初入文坛)

[求助] 想请教一下做RACE时,特异性引物的设计问题,以及如何根据同源保守区设计引物?

我是一个做分子生物学的新手,老师也没太多时间知道,所以的问题都要靠自己摸索。所以我的问题在您看来若很弱智,请您耐心的解答,非常感谢。
    我想在利用RACE方法做植物上一个基因的全长,根据同源克隆法,利用DNAMAN比对序列后,如何选取保守区,选择保守区序列的位置和原则是什么?又如何根据保守区设计3‘引物和5’引物?还是先做3‘race,根据pcr产物再做5’race?非常感谢。
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核酸生物学实验经验 RACE

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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-23 11:45:40
首先得NCBI上找到相似物种的cDNA序列,比对下,根据同源保守区(就是物种之间都没有变化的序列)设计两条GSP,两者之间隔个100bp-200bp左右吧!3‘RACE简单点
3楼2013-08-22 21:33:39
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普通回帖

夏菡小屋

金虫 (正式写手)

同问啊。
2楼2013-08-22 20:38:55
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zqxy1223

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xuzhu598 at 2013-08-22 21:33:39
首先得NCBI上找到相似物种的cDNA序列,比对下,根据同源保守区(就是物种之间都没有变化的序列)设计两条GSP,两者之间隔个100bp-200bp左右吧!3‘RACE简单点

可是我的这个基因我选取的保守区,设计的引物GC含量都很低,已经设计了多条,都很低,该怎么办?
4楼2013-08-23 15:23:03
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zqxy1223 at 2013-08-23 15:23:03
可是我的这个基因我选取的保守区,设计的引物GC含量都很低,已经设计了多条,都很低,该怎么办?...

primer长度25-27bp左右吧,GC%有40吗?理论很多时候和实际不一样的,建议你多设计几条!3‘相对来说简单多了,问题应该不大。
5楼2013-08-23 20:46:26
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fantasist001

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
确保每个引物的3‘端都在完全or最保守区。先做3端是正道。
6楼2013-08-23 21:51:20
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zqxy1223

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by xuzhu598 at 2013-08-23 20:46:26
primer长度25-27bp左右吧,GC%有40吗?理论很多时候和实际不一样的,建议你多设计几条!3‘相对来说简单多了,问题应该不大。...

在弱弱的问一下,我根据其他物种来寻找保守区,设计引物,是不是应该设计简并引物啊~~
7楼2013-08-24 10:04:36
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zqxy1223

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by fantasist001 at 2013-08-23 21:51:20
确保每个引物的3‘端都在完全or最保守区。先做3端是正道。

因为我没有已知片段,我是不是应该先设计简并引物,P出一段序列,在做3‘端啊?
8楼2013-08-24 10:05:39
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zqxy1223 at 2013-08-24 10:05:39
因为我没有已知片段,我是不是应该先设计简并引物,P出一段序列,在做3‘端啊?...

不是简并引物,你找几个相似的物种来设计就可以了!
9楼2013-08-24 22:18:26
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暗星

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我觉得先根据其他物种基因的保守区设计兼并引物,在你做的物种上扩兼并引物之间的序列
然后根据测得本物种的序列设计特异引物,先做3‘
最后做5’
浅显的意见!
10楼2013-08-25 11:10:19
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