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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR条带不够亮的原因
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR条带不够亮的原因

pcr产物跑琼脂糖，条带不够亮，已经重复了很多次还是不够亮，为什么呢？
下一步想要做dgge，可以继续么？
PCR条带不够亮的原因
0821pcr.JPG
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1楼 2013-08-22 09:27:23
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by pypsak at 2013-08-22 09:28:43
木有marker对照，不知道哪里出问题了

之前跑过带marker的，marker也是不亮，但是看到别人做过也有marker不亮但是pcr产物条带很亮的，为什么我的做来做去都还是不亮呢？
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5楼2013-08-22 13:04:09
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by shiq250 at 2013-08-22 09:33:15
请提供marker 有可能是PCR产物浓度很低

那怎样才能提高pcr浓度呢？改变退火温度？
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6楼2013-08-22 13:05:18
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by hkqgeoffrey at 2013-08-22 09:56:37
没有DNAmarker,不过从图片上看楼主的电泳中并没有可用条带啊    而且跑电泳时间好像也短了，需要跑整个胶的2/3方可  楼主跑的是1%琼胶吗？

没有可用的条带？？那我的条带是什么？？我一般都是跑20min，基本在1/3-1/2处，用的是1%琼胶，那我是不是需要延长下时间呢
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7楼2013-08-22 13:07:26
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)
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11楼: Originally posted by hyphen007 at 2013-08-22 20:36:44
PCR参数是怎样的呢？原因很多

用的是357f和518r
94℃    5min
94℃    40s
53℃     40s
72℃     1min
72℃      7min
30cycles。
后来改变条件也试过35循环，55℃，效果都不好，亮度差别不大。是什么原因？
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18楼2013-08-26 10:05:10
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)
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19楼2013-08-26 10:07:34
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)
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16楼: Originally posted by 天外飞仙-01 at 2013-08-24 13:28:54
没有扩出来，可以尝试降低退火温度。而且为什么没有marker呢，很难判断胶是否有问题。

没有扩出来？？？
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20楼2013-08-26 10:10:14
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by hkqgeoffrey at 2013-08-22 18:22:39
因为你没有DNAmarker   我大概判断你误认是条带的可能是溴酚蓝的颜色带，建议把阳性对照做好  一般我们跑1%琼胶都是110-120V35min  1%胶20分钟有点短  要是分离1.5K的条带估计看不见了...

应该不会是没有扩出来吧？之前点的marker也是在200bp左右的，如果是溴酚蓝的颜色带应该再最底部吧。我的条带一直不亮，到底是什么原因啊，着急！！
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21楼2013-08-26 20:18:03
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毛毛讨厌猫

新虫 (初入文坛)
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22楼: Originally posted by hkqgeoffrey at 2013-08-27 09:22:55
溴酚蓝分子量较电泳的物质而言分子量很小，所以跑得最快，在最前部，而且没有marker难以判断胶是否有问题，PCR会有失败，原因很多（比如退火温度、引物、与变性时间等等  ，楼主再多查阅资料分析下吧），还是要分析 ...

好的，谢谢了，我试着做了巢式的，结果还行
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23楼2013-08-28 10:23:15
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