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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 琼脂糖电泳rna ，跑成这样，是怎么回事？求指导
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)

[求助] 琼脂糖电泳rna ，跑成这样，是怎么回事？求指导

Sample Text

我做的是马氏珠母贝的外套膜和边缘膜的RNA的提取

操作步骤是这样的：
1、样品早上10点从贝中提取出来，接着在液氮中冻存并保存了4个小时
2、下午2点做，用于depc处理过的2微升管取样并加入tirzol  1ml，加入小钢珠，用匀浆器匀浆8分钟
3、用镊子取出小钢珠，放置5min
4、加入氯仿200微升，涡旋30s
4、12000r，4℃，15min
5、吸取上清400微升于depc处理过的1.5ml离心管中，异丙醇400微升
6、室温放置10min
7、12000r，4℃，10min
8、弃去上清，加入1ml 的75%depc配置的乙醇，剧烈震荡
9、12000r，4℃，5min
10、在垂直层流操作台晾干10min，加入20微升的depc水溶解（没有pcr ，也没有测过其浓度，师姐说不用，测没意义）。
11、琼脂糖凝胶电泳 ，其余样品-80℃保存。
12、琼脂糖凝胶的配置：
        凝胶浓度：1%   
       电压：120V
       电流：60MA
       跑的时间：30min
缓冲液：0.5xTBE
琼脂糖电泳rna ，跑成这样，是怎么回事？求指导
RNA电泳图.PNG

[ Last edited by 键盘上的脚丫 on 2013-8-19 at 20:53 ]
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1楼 2013-08-19 20:52:43
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by longrna at 2013-08-20 10:08:01
贝类？建议先查找资料看是否有人提取过同类型的样品。
有些样品的RNA并不是都3条带的。我提取只有一条带的物种，也有一些其28非常弱，基本不可见。
你可以电泳时点一个正常样品（动物肝脏或水稻）的total RNA
ma ...

恩恩，我准备去测一下od值先，下午再跑一次电泳，谢谢吖
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7楼2013-08-20 12:20:43
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by biology-boy at 2013-08-19 22:32:12
是RNA 降解了吧，提RNA时一定要快，我们做的菌在液氮中研磨都是要很快的，你的是不是匀浆时间长了？

因为用机器匀浆，很难看效果，所以就设置时间长一点，没想到效果这么差，嗯，我会改进的，谢谢
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8楼2013-08-20 12:21:46
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 15879003030 at 2013-08-19 21:06:37
这是RNA吗？少了一条带啊。

为什么不用热酚法抽RNA，你这个方法我没用过不知道效果。

热酚法没试过，我再试试
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9楼2013-08-20 12:24:41
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
键盘上的脚丫: 回帖置顶 2013-08-20 18:06:56
引用回帖:
6楼: Originally posted by longrna at 2013-08-20 10:08:01
贝类？建议先查找资料看是否有人提取过同类型的样品。
有些样品的RNA并不是都3条带的。我提取只有一条带的物种，也有一些其28非常弱，基本不可见。
你可以电泳时点一个正常样品（动物肝脏或水稻）的total RNA
ma ...

这是我中午测得od值，看到曲线之后，我大概知道自己做错了那些，在此提给大家，望大家引以为戒。

由图可得：
1、编号1、2的两个样品都是属于提出了RNA， 但是里面的量太少。
2、编号3、4、5、6这四个样品，都出现双峰，很明显之前操作的时候，没有把酒精晾干，同时，降解也是比较厉害的，不能达到反转录的要求。

改进措施：
1、晾干酒精，一定要去除
2、操作要迅速，可以先把1ml的tirzol和小钢珠先准备好，再加入样品，迅速研磨，减少RNA降解的量
3、取贝的组织的时候，要小心，不要把生殖腺搞破，里面有很多让RNA降解的酶。
4、在加入depc水制的75%酒精之后，应该是轻轻的上下摇晃两次，而不是剧烈震荡。

以上是小弟的总结，望各大虫指点~ 谢谢~
琼脂糖电泳rna ，跑成这样，是怎么回事？求指导-1
测OD.PNG
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11楼2013-08-20 18:01:03
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by longrna at 2013-08-21 12:08:58
测OD也无法判断呵，只能大概看看纯度和产量什么的。
应该是样品本身RNA就长这个样子。...

嗯，主要是RNA降解了…
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13楼2013-08-22 00:56:14
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 石头雪儿 at 2013-08-25 15:06:31
匀浆的话，最好还是用液氮吧，这样处理温度低，耗时短，有利于防止RNA酶的作用，从你跑的胶上来看，好像是降解了吧，一般情况下是能看到三条带的

嗯，因为只是做毕业课题，所以，用匀浆器方便点，不用准备那么久。

后面我查找了原因，主要是我加的样品过量，导致其降解。

那个图是我后面重新提取的RNA的电泳图，OD值都不错，浓度也好。
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15楼2013-08-26 23:44:33
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