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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)

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[求助] 琼脂糖电泳rna ，跑成这样，是怎么回事？求指导

Sample Text

我做的是马氏珠母贝的外套膜和边缘膜的RNA的提取

操作步骤是这样的：
1、样品早上10点从贝中提取出来，接着在液氮中冻存并保存了4个小时
2、下午2点做，用于depc处理过的2微升管取样并加入tirzol  1ml，加入小钢珠，用匀浆器匀浆8分钟
3、用镊子取出小钢珠，放置5min
4、加入氯仿200微升，涡旋30s
4、12000r，4℃，15min
5、吸取上清400微升于depc处理过的1.5ml离心管中，异丙醇400微升
6、室温放置10min
7、12000r，4℃，10min
8、弃去上清，加入1ml 的75%depc配置的乙醇，剧烈震荡
9、12000r，4℃，5min
10、在垂直层流操作台晾干10min，加入20微升的depc水溶解（没有pcr ，也没有测过其浓度，师姐说不用，测没意义）。
11、琼脂糖凝胶电泳，其余样品-80℃保存。
12、琼脂糖凝胶的配置：
      凝胶浓度：1%
   电压：120V
   电流：60MA
   跑的时间：30min
缓冲液：0.5xTBE

RNA电泳图.PNG

[ Last edited by 键盘上的脚丫 on 2013-8-19 at 20:53 ]

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1楼 2013-08-19 20:52:43

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键盘上的脚丫

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键盘上的脚丫: 回帖置顶 2013-08-20 18:06:56

引用回帖:

6楼: Originally posted by longrna at 2013-08-20 10:08:01
贝类？建议先查找资料看是否有人提取过同类型的样品。
有些样品的RNA并不是都3条带的。我提取只有一条带的物种，也有一些其28非常弱，基本不可见。
你可以电泳时点一个正常样品（动物肝脏或水稻）的total RNA
ma ...

这是我中午测得od值，看到曲线之后，我大概知道自己做错了那些，在此提给大家，望大家引以为戒。

由图可得：
1、编号1、2的两个样品都是属于提出了RNA，但是里面的量太少。
2、编号3、4、5、6这四个样品，都出现双峰，很明显之前操作的时候，没有把酒精晾干，同时，降解也是比较厉害的，不能达到反转录的要求。

改进措施：
1、晾干酒精，一定要去除
2、操作要迅速，可以先把1ml的tirzol和小钢珠先准备好，再加入样品，迅速研磨，减少RNA降解的量
3、取贝的组织的时候，要小心，不要把生殖腺搞破，里面有很多让RNA降解的酶。
4、在加入depc水制的75%酒精之后，应该是轻轻的上下摇晃两次，而不是剧烈震荡。

以上是小弟的总结，望各大虫指点~ 谢谢~