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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » CTAB法提取真菌DNA的求助
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christll

新虫 (初入文坛)

[求助] CTAB法提取真菌DNA的求助

我做的是白腐真菌DNA的提取，用于全基因组的测序。由于该菌大量产硬葡聚糖，所以操作中会有去除多糖的步骤。各位大神，我都忙活了一学期了，一直重复，一直失败。请大神们指点迷津，不胜感激！
具体步骤如下：
1、取250mg菌体液氮石英砂充分碾磨，装入10ml离心管；
2、加入3mlCTAB提取液，60ul ß-巯基乙醇，剧烈振荡至样品分散均匀；
65℃水浴30min，其间颠倒2-3次；
3、加入1ml无水乙醇及1ml 5M KAC，充分混匀，冰上放置1h；
至室温后，加入3ml 氯仿异戊醇（24:1），充分混匀；
12000rpm，10min, 4℃；
4、取上清，加入等体积的碱酚氯仿异戊醇（25:24:1）,充分混合；
12000rpm，10min, 4℃；
5、重复7、8步骤，至界面无明显杂质；
6、氯仿异戊醇（24:1）再一次抽提；
7、上清液加入10% v/v的3M KAC及2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，挑出絮状沉淀， 沉淀用75%乙醇漂洗2次，真空干燥；
8、100ul ddH2O溶解DNA，10ul RNase (10ug/ul)20min;\
9、电泳检测。
醇沉淀的时候出现大量白色絮状物，貌似DNA的絮状物，75%乙醇漂洗之后，真空烘干后稍微有点难溶。然后就是跑胶，跑胶结果如附件：（每次结果都差不多，一直找不到问题在哪儿）
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  • 附件 1 : 跑胶图片.doc
    • 2013-08-17 20:11:34, 1.44 M

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1楼 2013-08-17 20:20:34
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christll

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yimingwang at 2013-08-18 00:49:09
那一陀就是糖。建议你第7步步要挑出沉淀，而是12000rpm, 15 min, 水溶解。不溶解的部分直接丢掉。把溶解的部分再用PCI，Chloroform纯化，沉淀。就能得到好点的Genomic DNA了。

其实我之前做过将絮状物沉淀溶解之后再用酚氯仿抽提的，一用醇沉淀还是那种絮状物，再次跑胶的时候也还是图片的那种情况。我现在就是搞不清楚提取出来的絮状物具体是什么，为什么跑胶出来前面有大量的小片段，DNA是压根没提取出来还是降解掉了。。。。找不到原因
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3楼2013-08-18 17:12:21
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
christll(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-19 18:33:54
那一陀就是糖。建议你第7步步要挑出沉淀，而是12000rpm, 15 min, 水溶解。不溶解的部分直接丢掉。把溶解的部分再用PCI，Chloroform纯化，沉淀。就能得到好点的Genomic DNA了。
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Let'sdoit.
2楼2013-08-18 00:49:09
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
christll(gyesang代发): 金币+2, 鼓励交流！ 2013-08-19 18:34:00
你的gDNA已成功提取。即前面很淡的条带即为DNA：但量少。由于你处理的过程经过你所谓的多步去多糖步骤导致提取产量低。
絮状物就是DNA（可能含有杂质）。
跑胶前面的大量小片段为RNA（该样品RNA含量应该很丰富，虽然后来有加RNase但去除还不完全。可以在65度水浴时即加入RNase处理。）
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伟大航线....
4楼2013-08-19 08:42:13
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nmzyl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by longrna at 2013-08-19 08:42:13
你的gDNA已成功提取。即前面很淡的条带即为DNA：但量少。由于你处理的过程经过你所谓的多步去多糖步骤导致提取产量低。
絮状物就是DNA（可能含有杂质）。
跑胶前面的大量小片段为RNA（该样品RNA含量应该很丰富，虽 ...

你好，请问我在提的时候基本也是这样，加冷的乙醇就出现白的絮状物，可是一离心，什么也没有了。不知道什么原因？恳请赐教，谢谢！
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美好一天从好心情开始
5楼2015-09-27 16:04:36
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