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蓝慧

木虫 (正式写手)

[交流] CTAB法提取DNA

Sample Text
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这是我用CTAB法提的DNA，虫友帮分析一下，为什么拖带这么厉害，图中已经用RNase消化过的。像这种的可以用来做后续PCR实验吗？

泳道1为2000的Marker,其他的为样品
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1楼2012-07-12 10:40:35
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elbo

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
蓝慧(金币+1): 谢谢参与
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-12 21:52:46
降解了，不是RNA的问题。提取过程中注意点，后面3个样品的点样孔里面有残留蛋白，可能会抑制PCR反应，最好纯化一下，你也可以找个引物试试看能P出来不。
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2楼2012-07-12 10:50:43
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by elbo at 2012-07-12 11:50:43
降解了，不是RNA的问题。提取过程中注意点，后面3个样品的点样孔里面有残留蛋白，可能会抑制PCR反应，最好纯化一下，你也可以找个引物试试看能P出来不。

那如何在提取过程中防止其降解呢？
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3楼2012-07-12 11:28:06
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桃子老好吃

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
蓝慧(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-16 13:37:38
你提的是植物的还是细菌的DNA啊？我之前也是降解很厉害的，因为我的 TE配制出了问题，DNA在合适pH的TE缓冲液里面才比较稳定，你可以看看TE有没有配错。
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4楼2012-07-12 12:44:10
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 桃子老好吃 at 2012-07-12 13:44:10
你提的是植物的还是细菌的DNA啊？我之前也是降解很厉害的，因为我的 TE配制出了问题，DNA在合适pH的TE缓冲液里面才比较稳定，你可以看看TE有没有配错。

我提的是植物的。TE是以前的，大概用了一年，那我再配个新的试一下
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5楼2012-07-12 12:56:34
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太极拳

木虫 (小有名气)
★
蓝慧(金币+1): 谢谢参与
你这降解的不是一般的厉害！简直连主带都看不清了！认为是方法问题，或是试剂配置问题。我一般情况下，CTAB提取基因组，最后用ddH2O来溶解DNA
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6楼2012-07-12 16:38:34
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
★
蓝慧(金币+1): 谢谢参与
降解好厉害啊，会不会材料本身就降解了？
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7楼2012-07-12 16:54:03
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elbo

金虫 (小有名气)
DNA在TE里面还是比较稳定的。8.0TE，
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8楼2012-07-12 19:19:54
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by coal@live.cn at 2012-07-12 17:54:03
降解好厉害啊，会不会材料本身就降解了？

材料是刚取不久的，没理由啊，再说DNA不容易降解吧。
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9楼2012-07-12 20:10:38
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-16 13:38:05
引用回帖:
9楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-07-12 20:10:38
材料是刚取不久的，没理由啊，再说DNA不容易降解吧。...

有DNase在的话就极易降解，而DNase这种东西只要材料一出现伤口就会大量释放。

种子或茎杆倒还好，如果是叶片等幼嫩材料的话剪下就应该立即放入冰盒或者液氮中，然后奔回实验室丢-70℃冰箱的。
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10楼2012-07-12 20:42:55
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霹雳光

至尊木虫 (著名写手)
★
蓝慧(金币+1): 谢谢参与
我也是刚学的，顺便学习一下
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11楼2012-07-12 21:14:38
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by coal@live.cn at 2012-07-12 21:42:55
有DNase在的话就极易降解，而DNase这种东西只要材料一出现伤口就会大量释放。

种子或茎杆倒还好，如果是叶片等幼嫩材料的话剪下就应该立即放入冰盒或者液氮中，然后奔回实验室丢-70℃冰箱的。...

我取下后，就用液氮冻过了，之后一直放在-80℃冰箱
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12楼2012-07-12 22:41:16
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嘻哈武士

新虫 (初入文坛)
学习了
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13楼2012-07-13 09:59:07
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-13 16:13:54
引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-07-12 22:41:16
我取下后，就用液氮冻过了，之后一直放在-80℃冰箱...

不是冻过就行的，在丢冰箱前如果解冻那就没意义了。

如果取材没问题的话，那就是研磨时出问题了。研磨时同时也要注意不要让材料解冻，研磨完后就迅速将冷冻状态的粉末转移至预热的CTAB中，因为CTAB提取液中的EDTA和巯基乙醇都能抑制DNase，所以从这步开始基本不用担心降解了。

如果前面几步都正确但还是降解，那就只能是你操作过程中产生的强烈的机械剪切，包括使用涡旋仪、用枪头反复吹吸、丝状沉淀出现后还剧烈振荡等。
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14楼2012-07-13 10:18:59
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by coal@live.cn at 2012-07-13 11:18:59
不是冻过就行的，在丢冰箱前如果解冻那就没意义了。

如果取材没问题的话，那就是研磨时出问题了。研磨时同时也要注意不要让材料解冻，研磨完后就迅速将冷冻状态的粉末转移至预热的CTAB中，因为CTAB提取液中的ED ...

谢谢，我再试一下。多谢你的意见！
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15楼2012-07-13 11:17:51
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charlen520

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我提取的没有怎么降解呀
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16楼2012-07-15 10:19:51
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的样品放的时间很长吗？RNase消化多长时间？植物组织的DNA没提过，以前用CTAB做过动物的，感觉这种方法很好使
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17楼2012-07-15 12:25:47
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-15 13:25:47
你的样品放的时间很长吗？RNase消化多长时间？植物组织的DNA没提过，以前用CTAB做过动物的，感觉这种方法很好使

放不多正好一个月，RNase消化20分钟
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18楼2012-07-15 14:48:19
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-07-15 14:48:19
放不多正好一个月，RNase消化20分钟...

一个月的话，应该没啥问题的，RNase消化也差不多，按道理i讲，应该不会出现降解这么厉害，我觉得你是不是换一下其他的试剂，看看有哪些试剂可能会出问题
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19楼2012-07-15 21:51:36
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-15 22:51:36
一个月的话，应该没啥问题的，RNase消化也差不多，按道理i讲，应该不会出现降解这么厉害，我觉得你是不是换一下其他的试剂，看看有哪些试剂可能会出问题...

谢谢建议！我试一下
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20楼2012-07-15 21:55:45
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