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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 丝状真菌提取总DNA问题
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cclday

银虫 (正式写手)

[求助] 丝状真菌提取总DNA问题

CTAB法提取真菌DNA最后用异丙醇沉淀后使用无菌水无法完全溶解沉淀，这事怎么回事？

[ Last edited by cclday on 2011-6-14 at 08:39 ]
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1楼2011-06-14 07:58:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3, EPI+1): 鼓励应助 2011-06-14 19:00:12
2.4.14.1真菌总DNA的提取
（1）接种菌株至液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养3天；
（2）用灭菌纱布过滤，并压干菌体；
（3）将菌丝体倒入研钵（灭菌并预冷），迅速倒入液氮，研磨至粉末状；
（4）将粉末移至1.5mL的EP管中，加入600µL真菌提取液；
（5）加等体积苯酚/氯仿，轻轻倒转混合，10000rpm离心10min；
（6）取400µL上清液移入新的1.5mlLEP管，重复步骤（5）；
（7）取上清液，加入两倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；
（8）10000rpm 离心10min，75%乙醇洗沉淀2次，真空干燥；
（9）以20µL 1×TE 溶解沉淀；
（10）电泳检测总DNA的浓度。

（5）DNA抽提液的配置
表 2.5  DNA抽提液的配置
成分        浓度
NaCl        200mmol/L
EDTA-Na2        4mmol/L
SDS        2%
Tris-HCl(pH=8.0)        100mmol/L
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-06-14 17:09:56
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普通回帖

疯狂修行者

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

cclday(金币+5): 2011-06-14 09:01:37
amisking(EPI+1): 鼓励应助 2011-06-14 19:00:02
（1）可能是你干燥时间太长了，你可以放在65度下煮一下，或者把水先65度预热。
（2）也可能是你提取的DNA不纯，有杂质。

你可以试一下有尿素提取的方法，以前我用过，参考文献：
一种提取植物基因组DNA的方法 改良尿素法
曹文波 ，郑璐璐 ，谢文海
(1．华中师范大学生命科学学院，武汉430079；2．广西玉林师范学院，广西玉林537000)
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戒骄戒躁，坦荡做人，平常心做事，享受生活之美！！
2楼2011-06-14 08:53:24
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cclday

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 疯狂修行者 at 2011-06-14 08:53:24:
（1）可能是你干燥时间太长了，你可以放在65度下煮一下，或者把水先65度预热。
（2）也可能是你提取的DNA不纯，有杂质。

你可以试一下有尿素提取的方法，以前我用过，参考文献：
一种提取植物基因组DNA的方法 ...

按照你方法1我先试试。谢谢了
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3楼2011-06-14 09:01:25
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

cclday(金币+5): 2011-06-14 17:08:29
应该是蛋白质没有除尽的  多抽提几次~
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2011-06-14 15:11:53
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
µL  是发上来之后出现的乱码，微升
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6楼2011-06-14 17:11:22
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang
可能是杂质未除尽~~~~我以前也碰到过，看你提ＤＮＡ做什么用，如果要求质量不是很高的话可以把溶解了的纯化一下，肯定多少都提出来一些了的。
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每天进步一点点，持之以恒！
7楼2011-06-14 18:50:34
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cclday

银虫 (正式写手)
谢谢大家的热心帮助。
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8楼2011-06-15 08:20:29
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-14 17:09:56:
2.4.14.1真菌总DNA的提取
（1）接种菌株至液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养3天；
（2）用灭菌纱布过滤，并压干菌体；
（3）将菌丝体倒入研钵（灭菌并预冷），迅速倒入液氮，研磨至粉末状；
（4）将粉末移至 ...

我也要做真菌方面的课题，不知道氯化苄法行不行,请指教~~~~
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9楼2011-06-15 16:40:43
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
Originally posted by liuyu_sdili at 2011-06-15 16:40:43:
我也要做真菌方面的课题，不知道氯化苄法行不行,请指教~~~~

我对这个方法不了解，第一次听说，所以就查了一下，不敢说我查到的东西是真的或者是最好的，就说一下我的想法：这个方法太浪费时间了，单单是破碎细胞就要保温一个小时！而且操作也不比我用的方法简单，试剂也不省，实在不适合我用，但不是说不适合别人用。这些也只是我的想法，别人怎么看我就不知道了。

http://www.ceps.com.tw/ec/ecjnlarticleView.aspx?atliid=435190
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10楼2011-06-15 17:03:09
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