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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 这两个酶切位点有问题吗？
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 这两个酶切位点有问题吗？ 已有4人参与

最近本人在做Spe1和Sac1这两个酶的双酶切连接实验，可是连接后做热击转化就是不长单菌落，回收分别测了浓度，摩尔比是1：3-1：10，连接时16℃过夜，涂皿再过夜，就是不长单菌落，是什么原因？？急得很呐 郁闷！！！！
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1楼 2013-08-12 13:24:18
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yhbletter

铜虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-12 17:00:13
1，你这两种酶是哪个公司的
2，你的载体骨架和片段双酶切后分别是多大，是哪个载体
3，抗性是什么
4，用的什么连接试剂盒
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2楼2013-08-12 13:37:12
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mamadexiao

木虫 (正式写手)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-13 09:11:58
作对照了么？
抗性对了了？
你转化完恢复的时候，培养基用没用有抗性的啊？
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3楼2013-08-12 21:39:52
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zugur

新虫 (初入文坛)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-13 09:12:11
检测一下你载体的抗性基因跟你加在皿里的药是不是一样，我见过这样的失败例。

另外，双酶切出的克隆本就少，如果可以皿里多涂菌液。
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4楼2013-08-13 07:15:43
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卷舒_ray

金虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-13 09:12:18
这玩意最关键的是对照
转化阳性对照；
连接反应不加外源片段只有双酶切载体的对照——这是常常被忽略的对照，然而只有这个对照没有转化产物才能说明至少你的双酶切是成功的然后才能将重点放在连接的比例上。
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5楼2013-08-13 09:05:36
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卷舒_ray

金虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-13 16:30:14
建议：
1.虽然双酶切可以同时加两个酶一起进行，但如果逐个来更能确保酶切效果，尤其是如果有比较难切的酶，先确保单酶切成功，回收后再用另一个比较好切的酶
2.连接体系小些，全部转化，最后菌液离心重悬后全部涂一块抗性板，当然，上面提到的连接反应设立的阴性对照也如是操作，只有阴性对照几乎没有或至少比实验组明显少菌落的前提下才有可能有重组子
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6楼2013-08-13 09:12:29
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhbletter at 2013-08-12 13:37:12
1，你这两种酶是哪个公司的
2，你的载体骨架和片段双酶切后分别是多大，是哪个载体
3，抗性是什么
4，用的什么连接试剂盒

用的NEB的酶，载体骨架是10K,目的片段是1k。连接试剂盒？我们不用这个的，我的连接体系是10微升，T4连接酶1微升，10倍连接buffer1微升，其他加载体和目的片段，我的两者的浓度是6.0左右纳克/微升，这个浓度是不是有点小？？？？
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7楼2013-08-13 12:02:57
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yhbletter

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
7楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-08-13 12:02:57
用的NEB的酶，载体骨架是10K,目的片段是1k。连接试剂盒？我们不用这个的，我的连接体系是10微升，T4连接酶1微升，10倍连接buffer1微升，其他加载体和目的片段，我的两者的浓度是6.0左右纳克/微升，这个浓度是不是有 ...

我们的连接体系里面载体最少是50ng
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8楼2013-08-13 14:48:52
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