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AlbaRosea

金虫 (初入文坛)

[求助] PCAMBIA1300系列载体表达初始ATG

各位大侠、
       请问一下就是pCAMBIA1301,1304等几个载体里边。顺时针的35s启动子下游，是从哪里的ATG开始读的呀？如果用ncoI 和bgl II 是不是都是从NCO I 的ATG开始读的呀？那么如果用这两个酶切位点，是不是都要在目标序列里补上两个碱基啊才能保证不会移码啊？（ 1 catggtagat ctgactagta aaggagaaga，摘自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF234298）
       生物基础薄弱啊。忘高人指点一下啊。谢谢。
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小小土博鼠
1楼 2013-07-10 13:50:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
AlbaRosea: 金币+10, ★★★很有帮助, 有帮助。谢谢 2013-07-11 16:28:39
myprayer: 金币+2, 回答很好，perfect 2013-07-12 08:35:13
是的。如果你的基因开始是序列是ATGG，克隆设计5'引物的时候可以直接利用NcoI酶切位点的序列，从第五个碱基开始克隆。如果基因的第四个碱基不是G，你需要在基因序列前面补充两个碱基。
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2楼2013-07-11 07:52:20
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AlbaRosea

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-11 07:52:20
是的。如果你的基因开始是序列是ATGG，克隆设计5'引物的时候可以直接利用NcoI酶切位点的序列，从第五个碱基开始克隆。如果基因的第四个碱基不是G，你需要在基因序列前面补充两个碱基。

大侠，追问两个个问题。
（1）如果在BGL II的位置插入基因，前边的两个碱基怎么补呢？有没有什么原则？
（2）如果是要表达GFP或者GUS融合蛋白的话，是不是加了两个碱基之融合蛋白无法表达了，因为GFP的初始表达是NCOI的ATG，而没有移码，要是加入两个碱基，虽然目的基因表达没有问题了，但是对GFP来说移码了对吧？
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小小土博鼠
3楼2013-07-12 20:10:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by AlbaRosea at 2013-07-12 20:10:35
大侠，追问两个个问题。
（1）如果在BGL II的位置插入基因，前边的两个碱基怎么补呢？有没有什么原则？
（2）如果是要表达GFP或者GUS融合蛋白的话，是不是加了两个碱基之融合蛋白无法表达了，因为GFP的初始表达是 ...

如果是融合蛋白，如果你的目的基因在GFP或者GUS前面（比方说你用NcoI, BglII, SpeI），你需要去掉目的基因的终止密码子并核对从你克隆位点后面的序列到融合基因的ATG之间的碱基数目是3的倍数，如果不是需要在克隆基因时的3'引物处补碱基。如果你把目的基因连在报告基因后面，你需要保证的是去掉报告基因终止密码子，并且从此处到目的基因的ATG之间的碱基数目是3的倍数而不移码。如果做融合蛋白，为了保证折叠的独立和稳定，往往可以在两个蛋白之间加linker。
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4楼2013-07-12 23:05:48
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AlbaRosea

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-12 23:05:48
如果是融合蛋白，如果你的目的基因在GFP或者GUS前面（比方说你用NcoI, BglII, SpeI），你需要去掉目的基因的终止密码子并核对从你克隆位点后面的序列到融合基因的ATG之间的碱基数目是3的倍数，如果不是需要在克隆基 ...

高手，觉得你说的很有道理啊。。就是不懂两个蛋白间的linker怎么选择啊？如果觉得菜鸟，我可以下来自己研究一下。

主要的问题是，我切掉BGLII的时候，往我的目的基因前边加碱基，这两个碱基怎么选择啊？表达的蛋白都不是从我的ATG开始的会不会就不是我的蛋白啊？那我的那个ATG还要么？表达出来的是什么东东呢？
谢谢大侠啦，终于找到了一个明白人。。麻烦啦。。这个是我最纠结的问题。。
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小小土博鼠
5楼2013-07-13 08:55:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
AlbaRosea: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢。。太谢谢了。。 2013-07-13 16:12:49
引用回帖:
5楼: Originally posted by AlbaRosea at 2013-07-13 08:55:30
高手，觉得你说的很有道理啊。。就是不懂两个蛋白间的linker怎么选择啊？如果觉得菜鸟，我可以下来自己研究一下。

主要的问题是，我切掉BGLII的时候，往我的目的基因前边加碱基，这两个碱基怎么选择啊？表达的蛋 ...

linker有很多种，就是短小的序列不形成高级折叠，使融合蛋分别独立折叠。常用的有甘氨酸linker。构建载体的时候往往在插入的位点与要融合的标签直接有一些碱基，所以通常情况下不做任何处理也往往可以成功表达出融合蛋白。我只是提醒一下而已。
目的基因前面加两个碱基一般是比较随意的，只要不形成终止子或者Pro这种对蛋白折叠构象发生较大影响的氨基酸就可以了。表达出来的蛋白比原来的目标蛋白多两个氨基酸，你的ATG可以保留。多两个氨基酸一般不会对蛋白的结构和功能造成什么影响。
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6楼2013-07-13 09:18:19
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