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33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 这两个酶切位点有问题吗? 已有4人参与

最近本人在做Spe1和Sac1这两个酶的双酶切连接实验,可是连接后做热击转化就是不长单菌落,回收分别测了浓度,摩尔比是1:3-1:10,连接时16℃过夜,涂皿再过夜,就是不长单菌落,是什么原因??急得很呐 郁闷!!!!
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33ggdf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yhbletter at 2013-08-12 13:37:12
1,你这两种酶是哪个公司的
2,你的载体骨架和片段双酶切后分别是多大,是哪个载体
3,抗性是什么
4,用的什么连接试剂盒

用的NEB的酶,载体骨架是10K,目的片段是1k。连接试剂盒?我们不用这个的,我的连接体系是10微升,T4连接酶1微升,10倍连接buffer1微升,其他加载体和目的片段,我的两者的浓度是6.0左右纳克/微升,这个浓度是不是有点小????
7楼2013-08-13 12:02:57
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yhbletter

铜虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-12 17:00:13
1,你这两种酶是哪个公司的
2,你的载体骨架和片段双酶切后分别是多大,是哪个载体
3,抗性是什么
4,用的什么连接试剂盒
2楼2013-08-12 13:37:12
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-13 09:11:58
作对照了么?
抗性对了了?
你转化完恢复的时候,培养基用没用有抗性的啊?
3楼2013-08-12 21:39:52
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zugur

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-13 09:12:11
检测一下你载体的抗性基因跟你加在皿里的药是不是一样,我见过这样的失败例。

另外,双酶切出的克隆本就少,如果可以皿里多涂菌液。
4楼2013-08-13 07:15:43
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