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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 这两个酶切位点有问题吗？
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 这两个酶切位点有问题吗？ 已有4人参与

最近本人在做Spe1和Sac1这两个酶的双酶切连接实验，可是连接后做热击转化就是不长单菌落，回收分别测了浓度，摩尔比是1：3-1：10，连接时16℃过夜，涂皿再过夜，就是不长单菌落，是什么原因？？急得很呐 郁闷！！！！
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1楼 2013-08-12 13:24:18
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhbletter at 2013-08-12 13:37:12
1，你这两种酶是哪个公司的
2，你的载体骨架和片段双酶切后分别是多大，是哪个载体
3，抗性是什么
4，用的什么连接试剂盒

用的NEB的酶，载体骨架是10K,目的片段是1k。连接试剂盒？我们不用这个的，我的连接体系是10微升，T4连接酶1微升，10倍连接buffer1微升，其他加载体和目的片段，我的两者的浓度是6.0左右纳克/微升，这个浓度是不是有点小？？？？
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7楼2013-08-13 12:02:57
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yhbletter

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-12 17:00:13
1，你这两种酶是哪个公司的
2，你的载体骨架和片段双酶切后分别是多大，是哪个载体
3，抗性是什么
4，用的什么连接试剂盒
赞一下 回复此楼
2楼2013-08-12 13:37:12
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mamadexiao

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-13 09:11:58
作对照了么？
抗性对了了？
你转化完恢复的时候，培养基用没用有抗性的啊？
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3楼2013-08-12 21:39:52
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zugur

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-13 09:12:11
检测一下你载体的抗性基因跟你加在皿里的药是不是一样，我见过这样的失败例。

另外，双酶切出的克隆本就少，如果可以皿里多涂菌液。
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4楼2013-08-13 07:15:43
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