应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 这两个酶切位点有问题吗？
81/1返回列表
查看: 1181  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 这两个酶切位点有问题吗？ 已有4人参与

最近本人在做Spe1和Sac1这两个酶的双酶切连接实验，可是连接后做热击转化就是不长单菌落，回收分别测了浓度，摩尔比是1：3-1：10，连接时16℃过夜，涂皿再过夜，就是不长单菌落，是什么原因？？急得很呐 郁闷！！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-08-12 13:24:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yhbletter

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-12 17:00:13
1，你这两种酶是哪个公司的
2，你的载体骨架和片段双酶切后分别是多大，是哪个载体
3，抗性是什么
4，用的什么连接试剂盒
赞一下 回复此楼
2楼2013-08-12 13:37:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mamadexiao

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-13 09:11:58
作对照了么？
抗性对了了？
你转化完恢复的时候，培养基用没用有抗性的啊？
赞一下 回复此楼
3楼2013-08-12 21:39:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zugur

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-13 09:12:11
检测一下你载体的抗性基因跟你加在皿里的药是不是一样，我见过这样的失败例。

另外，双酶切出的克隆本就少，如果可以皿里多涂菌液。
赞一下 回复此楼
4楼2013-08-13 07:15:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

卷舒_ray

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-13 09:12:18
这玩意最关键的是对照
转化阳性对照；
连接反应不加外源片段只有双酶切载体的对照——这是常常被忽略的对照，然而只有这个对照没有转化产物才能说明至少你的双酶切是成功的然后才能将重点放在连接的比例上。
赞一下 回复此楼
5楼2013-08-13 09:05:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

卷舒_ray

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-13 16:30:14
建议：
1.虽然双酶切可以同时加两个酶一起进行，但如果逐个来更能确保酶切效果，尤其是如果有比较难切的酶，先确保单酶切成功，回收后再用另一个比较好切的酶
2.连接体系小些，全部转化，最后菌液离心重悬后全部涂一块抗性板，当然，上面提到的连接反应设立的阴性对照也如是操作，只有阴性对照几乎没有或至少比实验组明显少菌落的前提下才有可能有重组子
赞一下 回复此楼
6楼2013-08-13 09:12:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhbletter at 2013-08-12 13:37:12
1，你这两种酶是哪个公司的
2，你的载体骨架和片段双酶切后分别是多大，是哪个载体
3，抗性是什么
4，用的什么连接试剂盒

用的NEB的酶，载体骨架是10K,目的片段是1k。连接试剂盒？我们不用这个的，我的连接体系是10微升，T4连接酶1微升，10倍连接buffer1微升，其他加载体和目的片段，我的两者的浓度是6.0左右纳克/微升，这个浓度是不是有点小？？？？
赞一下 回复此楼
7楼2013-08-13 12:02:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yhbletter

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-08-13 12:02:57
用的NEB的酶，载体骨架是10K,目的片段是1k。连接试剂盒？我们不用这个的，我的连接体系是10微升，T4连接酶1微升，10倍连接buffer1微升，其他加载体和目的片段，我的两者的浓度是6.0左右纳克/微升，这个浓度是不是有 ...

我们的连接体系里面载体最少是50ng
赞一下 回复此楼
8楼2013-08-13 14:48:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 33ggdf 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 8/400 2026-11-01 16:58 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 18/900 2026-11-01 16:48 by BCdvBAEpt3zm
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 13/650 2026-11-01 16:45 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 22/1100 2026-11-01 16:35 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 6/300 2026-11-01 15:04 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 6/300 2026-11-01 15:01 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 9/450 2026-11-01 14:55 by BCdvBAEpt3zm
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 8/400 2026-11-01 14:48 by BCdvBAEpt3zm
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 14/700 2026-11-01 14:24 by BCdvBAEpt3zm
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 7/350 2026-11-01 12:40 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 6/300 2026-11-01 12:40 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 10/500 2026-11-01 12:27 by BCdvBAEpt3zm
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 7/350 2026-11-01 12:27 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 11/550 2026-11-01 12:24 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 16/800 2026-11-01 12:14 by BCdvBAEpt3zm
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 15/750 2026-11-01 12:11 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 18/900 2026-11-01 12:11 by BCdvBAEpt3zm
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 5/250 2026-11-01 11:14 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 4/200 2026-11-01 11:01 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 申博自荐 2篇一区TOP+1篇EI+2公开发明专利 2027博士申请 +3 小小阿光 2026-10-27 3/150 2026-10-29 23:56 by 起风了的快乐
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭