应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 乳杆菌基因组PCR结果未得到目的基因
91/1返回列表
查看: 1357  |  回复: 8
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

~小绿~

铁虫 (小有名气)

[求助] 乳杆菌基因组PCR结果未得到目的基因

我是采用AxyPrep细菌基因组DNA小量提取试剂盒从一种乳杆菌中提基因组，
提了4次，最好的一次条带很浅，结果如图Lb DNA。
然后根据目的基因设计引物，引物中F的TM值为65.3，R的TM值为68.1，
PCR条件为：ddH2O 8.2ul
                     引物F 0.6ul
                     引物R 0.6ul
                     基因组 0.6ul
                    Primer STAR 10ul
设置的退火温度为55度，15s

跑出来的图有很多非特异性条带，无特别亮的条带。
我要的目的基因大小是750bp的，但这些条带中找不到，跪求各位大神帮我分析下
回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : Lb_DNA.png
    • 2013-08-07 11:47:23, 14.88 K
  • 附件 2 : Lb-PCR.jpg
    • 2013-08-07 11:54:25, 19.12 K

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
我可以
1楼2013-08-07 11:54:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
~小绿~: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-08-07 12:37:10
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致
2013-7-20

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：
1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。
考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。
调整变性和退火温度时间。
更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。
适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
更换DNA聚合酶，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。
　　 一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。
    过去，我也回答过PCR非特异性扩增的问题，但是这次回答我在2013年7月20日重新编辑核对的
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-08-07 12:01:09
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
本来还有些东西可以分析总结，但是今天没有时间了。楼主可以再听听其他网友的意见。

更正上文最后部分：调整镁离子浓度时，可以与dNTP正相关的梯度调整，两者同方向分梯度调节，一般不要放方向调节；但是可以镁离子浓度与dNTP浓度之一不动，调节另一个，而且先梯度调节镁离子浓度。
赞一下 回复此楼
3楼2013-08-07 12:06:07
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我在3楼的回答参考了yujitianqing的帖子，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669
过去我没有注意到，而后我去查阅了文献，与yujitianqing的帖子的内容基本上一致。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-08-07 12:10:37
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
更正2楼和3楼：调整镁离子浓度时，可以与dNTP正相关的梯度调整，两者同方向分梯度调节，一般不要反方向调节；但是可以单独镁离子浓度，而dNTP浓度之一不动；有时候dNTP浓度调整不大时也可以不动镁离子浓度，因为镁离子浓度太高了，可能会增加非特异性扩增。

我参考了yujitianqing的帖子，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669
过去我没有注意到，而后我去查阅了文献，有的文献与yujitianqing的帖子的内容基本上一致，也有些文献与yujitianqing的帖子的内容不一致。
赞一下 回复此楼
5楼2013-08-07 12:17:19
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

有时候dNTP浓度调整不大时也可以不动镁离子浓度，因为镁离子浓度太高了，可能会增加非特异性扩增，或者有时候就是可以不动dNTP浓度而只调节镁离子浓度也能够增加PCR的专一性。
赞一下 回复此楼
6楼2013-08-07 12:22:14
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

~小绿~

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-08-07 12:22:14
有时候dNTP浓度调整不大时也可以不动镁离子浓度，因为镁离子浓度太高了，可能会增加非特异性扩增，或者有时候就是可以不动dNTP浓度而只调节镁离子浓度也能够增加PCR的专一性。

非常感谢应助，但我们用的酶是商品酶，镁离子什么的都是加好的，估计能优化的只有退火温度了
赞一下 回复此楼
我可以
7楼2013-08-07 12:25:50
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by ~小绿~ at 2013-08-07 12:25:50
非常感谢应助，但我们用的酶是商品酶，镁离子什么的都是加好的，估计能优化的只有退火温度了...

1.商品酶也可以自己加减镁离子浓度，加不用说了，减少用超滤离心即可，顺便去掉些甘油。

2.还是不行，就使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。梯度降低PCR除了基因组DNA为模板外，一般的非基因组的DNA为模板也可以。我原来的帖子此处也有错，这里更正过来。

3.还可以使用巢式PCR。

4.最后，可以换做高忠实性的DNA复制酶，有现成很多种商品可以选择。
赞一下 回复此楼
8楼2013-08-07 12:32:55
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

~小绿~

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-08-07 12:32:55
1.商品酶也可以自己加减镁离子浓度，加不用说了，减少用超滤离心即可，顺便去掉些甘油。

2.还是不行，就使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高 ...

好的，非常感谢，先尝试下下~顺问，基因组提出来有一条大于10kb的单一条带，但比较浅，这对PCR应该影响不大的吧
赞一下 回复此楼
我可以
9楼2013-08-07 12:36:46
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 ~小绿~ 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭