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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因组DNA提取结果
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leon198418029

金虫 (小有名气)

[交流] 基因组DNA提取结果

从一开始做分子生物学实验，心中就有一个疑问：按照PROTOCOL提取出的DNA，电泳后呈现的条带数量，会不会正好就是染色体的数量。后来知道，DNA提取受到很多方面影响，提取出的DNA已经受到一定程度损伤，因此条带数目不确定。如图，图一显示的两种不同微藻的DNA提取结果。一般情况下，按照我实验室现有PROTOCOL提取出的DNA如右泳道所示，有一条几KB的条带同时带有拖尾。左边泳道未见条带，仅有拖尾，属于此次实验的特殊情况，该微藻之前DNA提取结果亦同右泳道。然而，用通用引物对其进行PCR，结果如图二，都得到了较好的结果。
    我不是在此讨论我的实验结果，只是想和大家研究讨论下DNA提取结果是什么样子，其受什么条件影响。在以前的实验室，用另一份PROTOCOL，电泳结果往往是几条几百BP和一两条上千BP的条带；而现在的PROTOCOL却带来了图示结果。我想知道，到底是否是PROTOCOL影响了DNA的提取结果。如果是，为什么有图一这样的结果；如果不是，为什么用不同PROTOCOL，同一种微藻提取出的电泳结果不同？是否还有其他影响因素？
    欢迎大家讨论交流，同时希望把你们的电泳结果发到这里来给各位看一下。
    PS:为什么好的RNA提取结果往往是电泳时看到三条清楚的条带？无论什么方法都这样吗？

gDNA



PCR
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1楼 2013-01-13 17:10:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
基因组DNA提取的时候即使很小心，也是被shear成十几K-几十K的片段的。不可能提出几M或者几十M大小的完整分子。你说的不同的方法不知道是哪里不同。我觉得主要的区别是操作中的机械力和杂质清除是否完全。一般提出来比较干净的DNA是会看到一条大于10K的带。你说的几百bp可能是没有完全降解掉的RNA。至于PCR的结果，因为机械力作用下DNA的断裂是随机的，如果DNA不是弄得太碎了，都应该可以P出来，所以你的两个样品都有扩增。当然断裂少的样品效果会更好一些。
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leon198418029
6楼2013-01-14 03:00:37
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普通回帖

weiwei_l

木虫 (职业作家)
★
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
加加油楼主
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2楼2013-01-13 17:35:23
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cory0931

至尊木虫 (文坛精英)
★
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
图一右边的比较认同；
我们实验室做细菌的同学跑出来只有一条带，拖尾也不明显；
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5楼2013-01-13 19:24:49
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leon198418029

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-14 03:00:37
基因组DNA提取的时候即使很小心，也是被shear成十几K-几十K的片段的。不可能提出几M或者几十M大小的完整分子。你说的不同的方法不知道是哪里不同。我觉得主要的区别是操作中的机械力和杂质清除是否完全。一般提出来 ...

感谢你提供的信息。如果提取过程对DNA的破坏是随机的，那么应该有很多片段才对啊，为什么会都聚集在几K的位置上呢？那些小一些的片段都变成SMEAR了嘛？有没有可能产生很多几K的片段，在电泳中形成若干条带？
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7楼2013-01-14 08:54:07
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
楼主说的很对，其实本来就是很多小片段，这是琼脂糖电泳分辨率太低，很多小片段的量比较少，看不到，只有多数比较完整的
至于RNA提取，三条带是rRNA，这个不知楼主有何疑问
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8楼2013-01-14 11:35:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by leon198418029 at 2013-01-14 08:54:07
感谢你提供的信息。如果提取过程对DNA的破坏是随机的，那么应该有很多片段才对啊，为什么会都聚集在几K的位置上呢？那些小一些的片段都变成SMEAR了嘛？有没有可能产生很多几K的片段，在电泳中形成若干条带？...

断裂是随机的，但是片段大小是呈正态分布的，所以分子量是集中在一个比较窄的范围，而且一般跑电泳在大分子量区域的分辨率有限，所以看到的是一条带。反正我是从来没有看到过弥散的带。如果出现很小的片段，说明你的操作有问题。提大分子本身需要注意尽量减少机械震荡。
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10楼2013-01-14 15:11:42
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hubinghello

金虫 (小有名气)
★
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
RNA3条带：28S，18S，5S
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11楼2013-01-14 19:40:14
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zjl2011115

新虫 (初入文坛)
★
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
虫友们好！初来咋到，还请多多关照。
我正用CTAB法提取柳杉的dna，但是最后用70%酒精洗涤俩次后仍然量很多，但是用去跑PCR时，没结果。
我的方法是：1，油液氮研磨成粉末，转到加油STE的离心管中，充分摇匀，离心10分钟，去上清留沉淀。加热好的CTAB水浴30分钟，中间摇匀5-8次
2.离心10min，汲取上清液，加等体积的氯仿异戊醇洗涤，（重复操作直至分层没有蛋白层）
3，2/3体积的冷异丙醇沉淀30min
4.70%抽提俩次
5.通风处催干
6.加30ul的TE溶解
在提取过程中，STE洗涤时糖分很多，不知道是不是糖分没去干净，还是怎么的，就是提不出来DNA，还请各位多多指教，万分感谢!
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12楼2013-01-17 20:32:28
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leon198418029

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zjl2011115 at 2013-01-17 20:32:28
虫友们好！初来咋到，还请多多关照。
我正用CTAB法提取柳杉的dna，但是最后用70%酒精洗涤俩次后仍然量很多，但是用去跑PCR时，没结果。
我的方法是：1，油液氮研磨成粉末，转到加油STE的离心管中，充分摇匀，离心 ...

你好，请问“但是最后用70%酒精洗涤俩次后仍然量很多”，这是什么的量很多？DNA吗？是不是有明显的小块白色物质？那也许是DNA，也许是为除净的蛋白质。另外，STE是什么？
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13楼2013-01-18 08:48:34
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
★
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
12楼: Originally posted by zjl2011115 at 2013-01-17 20:32:28
虫友们好！初来咋到，还请多多关照。
我正用CTAB法提取柳杉的dna，但是最后用70%酒精洗涤俩次后仍然量很多，但是用去跑PCR时，没结果。
我的方法是：1，油液氮研磨成粉末，转到加油STE的离心管中，充分摇匀，离心 ...

裸子植物一般含糖、酚等次代物多，如果说除不干净，应该在电泳图上有反应。不知道你DNA跑电泳是什么样。(还有1.酚易被氧化为醌，结合DNA。2.STE/CTAB的PH调好没,这个本人吃过亏)
PCR的话，模板浓度太大也没结果的，电泳有时还能看出来DNA带。我看你用30μLTE溶解，是不是模板浓度大了
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14楼2013-01-18 09:34:39
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zjl2011115

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by leon198418029 at 2013-01-18 08:48:34
你好，请问“但是最后用70%酒精洗涤俩次后仍然量很多”，这是什么的量很多？DNA吗？是不是有明显的小块白色物质？那也许是DNA，也许是为除净的蛋白质。另外，STE是什么？...

70%酒精洗涤时，剩下的提取物的量很多，很透明，我感觉应该是多糖吧，如果是DNA的话应该是白白的一点。STE是去除多糖的。
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15楼2013-01-18 09:48:34
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zjl2011115

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by ZOEY21 at 2013-01-18 09:34:39
裸子植物一般含糖、酚等次代物多，如果说除不干净，应该在电泳图上有反应。不知道你DNA跑电泳是什么样。(还有1.酚易被氧化为醌，结合DNA。2.STE/CTAB的PH调好没,这个本人吃过亏)
PCR的话，模板浓度太大也没结果的 ...

STE,CTAB的PH值都是跳过的啊 ，侧过DNA浓度，含量很低，并且跑电泳一点结果都没有，倒是2000mark的100bp以下面亮带
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16楼2013-01-18 09:53:22
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gpl110120

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
能给我说下微藻的通用引物序列么？
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18楼2015-08-31 19:47:43
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hi_20123楼
2013-01-13 17:38   回复  
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
nlbtr4楼
2013-01-13 18:23   回复  
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
duanepp9楼
2013-01-14 13:13   回复  
leon198418029(金币+1): 谢谢参与
ziyanqiuqian17楼
2013-05-24 12:23   回复  
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