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乳杆菌基因组PCR结果未得到目的基因
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我是采用AxyPrep细菌基因组DNA小量提取试剂盒从一种乳杆菌中提基因组， 提了4次，最好的一次条带很浅，结果如图Lb DNA。 然后根据目的基因设计引物，引物中F的TM值为65.3，R的TM值为68.1， PCR条件为：ddH2O 8.2ul 引物F 0.6ul 引物R 0.6ul 基因组 0.6ul Primer STAR 10ul 设置的退火温度为55度，15s 跑出来的图有很多非特异性条带，无特别亮的条带。 我要的目的基因大小是750bp的，但这些条带中找不到，跪求各位大神帮我分析下 |
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- 附件 2 : Lb-PCR.jpg
2013-08-07 11:47:23, 14.88 K
2013-08-07 11:54:25, 19.12 K
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
~小绿~: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-08-07 12:37:10
感谢参与，应助指数 +1
~小绿~: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-08-07 12:37:10
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PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致 2013-7-20 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：一．引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。对策：重新设计引物。二．Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度。三．靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因： 1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。 考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。 调整变性和退火温度时间。 更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。 适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。 更换DNA聚合酶，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。 使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。 一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。 过去，我也回答过PCR非特异性扩增的问题，但是这次回答我在2013年7月20日重新编辑核对的 |
2楼2013-08-07 12:01:09
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我在3楼的回答参考了yujitianqing的帖子，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669 过去我没有注意到，而后我去查阅了文献，与yujitianqing的帖子的内容基本上一致。 |
4楼2013-08-07 12:10:37
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更正2楼和3楼：调整镁离子浓度时，可以与dNTP正相关的梯度调整，两者同方向分梯度调节，一般不要反方向调节；但是可以单独镁离子浓度，而dNTP浓度之一不动；有时候dNTP浓度调整不大时也可以不动镁离子浓度，因为镁离子浓度太高了，可能会增加非特异性扩增。 我参考了yujitianqing的帖子，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669 过去我没有注意到，而后我去查阅了文献，有的文献与yujitianqing的帖子的内容基本上一致，也有些文献与yujitianqing的帖子的内容不一致。 |
5楼2013-08-07 12:17:19
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