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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 原核表达蛋白时标签无论在N端还是C端蛋白折叠时都被折进去了，怎么办
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蛋炒饭1989

金虫 (小有名气)

[求助] 原核表达蛋白时标签无论在N端还是C端蛋白折叠时都被折进去了，怎么办

各位虫虫好，我最近在做原核表达蛋白，用的标签是HIS-tag，发现标签无论是在N端还是在C端，蛋白折叠时都把它折进去了，纯化不了。我现在想的是是不是可以让蛋白什么标签都不带，按分子量去分。我的方向本来是电化学的，分子方面的很多都不懂，下一步不知道肿么办，求虫虫指点。
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春暖花开
1楼 2013-07-31 11:04:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-07-31 18:50:52
amisking: 金币+3, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-07-31 18:51:10
蛋炒饭1989: 金币+5 2013-08-01 20:24:54
蛋炒饭1989: 金币+4 2013-08-01 20:28:06
我想到4个办法:
办法1: 把发HIS换成GST, 因为GST自己有结构, 缺点是对目标蛋白的功能结构可能有破坏性的影响.
办法2: 在HIS和目标蛋白之间加linker, 比方说GGSGGSGGS, 使得HIS和目标蛋白的距离疏远些从而有机会不被折叠到内部, 缺点同上, 但是可能性小.
办法3: 研究蛋白的3级结构(有类似的蛋白晶体发表再好不过了), 把HIS放在目标蛋白中间某个位置, 而这个位置是暴露在外的.
办法4: 先用尿素对蛋白变性, 纯化后再复性.
办法2和3需要用mutagenesis办法实现, 楼主可以很容易在网上查到相关内容. 祝楼主成功
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9楼2013-07-31 17:48:00
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普通回帖

bleach060452

新虫 (小有名气)
★ ★
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2013-07-31 18:50:41
看你蛋白用来干啥了，要不要活性？

至于蛋白的分离纯化，这也不属于分子生物学的~~想用其他方法纯化，那就需要看你蛋白的特性、杂蛋白的影响了
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岂能尽如人意，但求无愧我心
2楼2013-07-31 11:43:14
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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蛋炒饭1989: 金币+3 2013-08-01 20:27:42
我不是很懂呀，你的折叠进去后蛋白是上清中表达还是包涵体形式？而且如果不需要活性的话，你是不是可以让蛋白变性舒展开呢？
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3楼2013-07-31 12:10:54
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蛋炒饭1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 欧阳-90 at 2013-07-31 12:10:54
我不是很懂呀，你的折叠进去后蛋白是上清中表达还是包涵体形式？而且如果不需要活性的话，你是不是可以让蛋白变性舒展开呢？

是在上清中，我的蛋白需要活性
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春暖花开
4楼2013-07-31 12:26:37
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蛋炒饭1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-31 11:43:14
看你蛋白用来干啥了，要不要活性？

至于蛋白的分离纯化，这也不属于分子生物学的~~想用其他方法纯化，那就需要看你蛋白的特性、杂蛋白的影响了

需要活性的，以后想把它放在电极上做酶传感器
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春暖花开
5楼2013-07-31 12:27:32
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-07-31 18:50:48
蛋炒饭1989: 金币+4 2013-08-01 20:27:13
蛋炒饭1989: 金币+4 2013-08-01 20:27:33
跑一下HIC，简单点的话跑一下非变形电泳，看看分子量是不是单体
说不定形成的是可溶性聚集体，介于包涵体沉淀和可溶蛋白之间的东西
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6楼2013-07-31 14:34:03
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蛋炒饭1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by roomofxw at 2013-07-31 14:34:03
跑一下HIC，简单点的话跑一下非变形电泳，看看分子量是不是单体
说不定形成的是可溶性聚集体，介于包涵体沉淀和可溶蛋白之间的东西

这个……不懂，还是谢谢你了
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春暖花开
7楼2013-07-31 16:12:04
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929519755

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试试别的纯化方法
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想你没话说
8楼2013-07-31 17:30:12
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匿名

用户注销 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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蛋炒饭1989: 金币+4 2013-08-01 20:27:25
本帖仅楼主可见
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10楼2013-07-31 19:05:23
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