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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 原核表达蛋白时标签无论在N端还是C端蛋白折叠时都被折进去了，怎么办
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 蛋炒饭1989 at 2013-07-31 12:26:37
是在上清中，我的蛋白需要活性...

标签纯化不是唯一的方法，就算是原核重组蛋白，同样我们可以考虑使用其他方法纯化，比如初步硫酸铵沉淀，结合其他的层析方法进行纯化。只是你可能需要摸索的时间会多一点
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11楼2013-08-01 09:06:20
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睿智的锐志

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蛋炒饭1989: 金币+4 2013-08-01 20:21:57
简单点，如何知道你的蛋白是折进去了？另外你的蛋白是什么可以让我们更好地判断情况。
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12楼2013-08-01 15:47:35
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蛋炒饭1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 睿智的锐志 at 2013-08-01 15:47:35
简单点，如何知道你的蛋白是折进去了？另外你的蛋白是什么可以让我们更好地判断情况。

变性的可以挂到柱子上，不变性的挂不上去。我提的蛋白是一种酶，以后要放到电极上检测底物，所以对活性要求比较高
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春暖花开
13楼2013-08-01 20:21:47
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蛋炒饭1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-07-31 17:48:00
我想到4个办法:
办法1: 把发HIS换成GST, 因为GST自己有结构, 缺点是对目标蛋白的功能结构可能有破坏性的影响.
办法2: 在HIS和目标蛋白之间加linker, 比方说GGSGGSGGS, 使得HIS和目标蛋白的距离疏远些从而有机会不 ...

这些个对我们实验室来说貌似挺难的……我现在时间比较紧，明年年初就毕业了，所以想要找个简便的方法，谢谢你哈
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春暖花开
14楼2013-08-01 20:24:48
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蛋炒饭1989

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-31 11:43:14
看你蛋白用来干啥了，要不要活性？

至于蛋白的分离纯化，这也不属于分子生物学的~~想用其他方法纯化，那就需要看你蛋白的特性、杂蛋白的影响了

以后要放到电极上做传感器，对活性要求比较高。
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春暖花开
15楼2013-08-01 20:25:35
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 蛋炒饭1989 at 2013-08-01 20:24:48
这些个对我们实验室来说貌似挺难的……我现在时间比较紧，明年年初就毕业了，所以想要找个简便的方法，谢谢你哈...

既然蛋白是一种酶, 那就用先变性纯化再然后再复性的办法吧, 以酶活度来判断复性的好坏.
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16楼2013-08-01 22:43:10
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
关于方法上面说得都蛮多的了，在此就没必要赘述。我觉得在做之前希望LZ认真确定自己蛋白是否真的被表达，因为N,C两端都被包被的可能性真的很少！Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
17楼2013-08-02 04:36:18
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

时间来不及，更要实验更得设计的仔细了，多看看相关文献。
0.看起来酶活很重要，是否一定需要纯化的很纯
1.是酶的话，纯化前的粗酶液是否有活性？
2.纯化后不挂柱子的流穿是否有酶活？
3.可溶形式的聚集，可能是非共价键造成的聚集，尝试改变buffer是不是会起作用
4.变性可以挂柱，那尝试加入低浓度的变性剂是否可以纯化。纯化后是否还有活性，低浓度尿素缓慢透析能否比较容易的复性
5.蛋白分子量结构如何，是否需要形成二聚之类的，是否可以尝试复性
6.既然是酶，还有传感器，那你们测酶活会很容易。实验中从发酵开始多取样检测酶活，看看问题出在哪里
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18楼2013-08-02 08:56:34
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

请问你是如何确定标签包被的？4如果真是包被就换标签，这是一个可行方法，或者就无标签，不过纯化起来难度变大了，也要看情况
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不想说什么，，，，
19楼2013-10-10 15:17:31
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