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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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学术问题

银虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量和半定量的问题??急!!在线等回复

我基因做半定量 条带不是太好。  我的半定量做了好几次了,效果就是不好,不知道是什么原因啊 ,可能是引物的问题。  我想请问可不可以直接做荧光相对定量实验啊,我想这样的话  我的引物有没有二聚体,有没有非特异性扩增就一目了然了啊。引物不行就直接换引物了,  我说的对不对啊??? 在线等答案…………………………
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微生物小硕
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩 2013-07-28 16:04:40
我不知道你说的半定量条带不好是指有引物二聚体,或者是有其它非特异条带?如果你做半定量PCR时能看到引物二聚体,直接说明引物不好,根本不用试荧光定量。因为荧光定量非常灵敏,如果胶上能看到的话荧光肯定能检测到引物的熔解峰。如果有非特异条带,经优化退火温度仍然不能去掉,也说明引物不好,直接换引物。
2楼2013-07-28 11:18:26
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学术问题

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-28 11:18:26
我不知道你说的半定量条带不好是指有引物二聚体,或者是有其它非特异条带?如果你做半定量PCR时能看到引物二聚体,直接说明引物不好,根本不用试荧光定量。因为荧光定量非常灵敏,如果胶上能看到的话荧光肯定能检测 ...

引物二聚体 倒不是很明显   有非特异性扩增,  目的条带非常的弱  只有内参特别亮!我觉得直接上荧光,引物行不行或者是其他什么问题,就可以直接知道了, 就不明白为什么还多此一举做个半定量,实在搞不懂?
微生物小硕
3楼2013-07-28 17:08:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-07-28 17:08:11
引物二聚体 倒不是很明显   有非特异性扩增,  目的条带非常的弱  只有内参特别亮!我觉得直接上荧光,引物行不行或者是其他什么问题,就可以直接知道了, 就不明白为什么还多此一举做个半定量,实在搞不懂?...

半定量比较省钱,而且对PCR仪器没太多要求。如果有条件可以直接用荧光,先做个引物退火温度梯度,看熔解曲线的效果。
4楼2013-07-28 23:09:59
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
学术问题(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-29 11:12:49
哥们。。。你的引物有问题是不能做荧光定量PCR的。好好重新设计引物,定量的引物还不好设计吗?设计好引物后利用普通PCR摸好退火温度和引物的量,然后再做实时荧光定量PCR。如果是半定量的话有二聚体也无所谓了。。。
keepon
5楼2013-07-29 08:12:10
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学术问题

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-07-29 08:12:10
哥们。。。你的引物有问题是不能做荧光定量PCR的。好好重新设计引物,定量的引物还不好设计吗?设计好引物后利用普通PCR摸好退火温度和引物的量,然后再做实时荧光定量PCR。如果是半定量的话有二聚体也无所谓了。。 ...

关键是我已经做了好多次了   而且是  结果一次不如一次,,我觉得我直接上一次荧光 不就完了吗? 就什么问题都解决了, 如果引物有二聚体,或者非特异性扩增,这些都能直接看出来啊, 那我就直接换引物了啊
微生物小硕
6楼2013-07-29 08:56:12
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小乖_1990

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
做荧光的话是不能有非特异性扩增的,引物二聚体也尽量没有。
走自己的路,让别人羡慕嫉妒恨去吧!!!
7楼2013-07-29 09:58:59
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-07-29 08:56:12
关键是我已经做了好多次了   而且是  结果一次不如一次,,我觉得我直接上一次荧光 不就完了吗? 就什么问题都解决了, 如果引物有二聚体,或者非特异性扩增,这些都能直接看出来啊, 那我就直接换引物了啊...

那你还是干脆换引物吧。。。
keepon
8楼2013-07-29 21:26:40
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