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学术问题

银虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量和半定量的问题？？急！！在线等回复

我基因做半定量 条带不是太好。  我的半定量做了好几次了，效果就是不好，不知道是什么原因啊 ，可能是引物的问题。  我想请问可不可以直接做荧光相对定量实验啊，我想这样的话  我的引物有没有二聚体，有没有非特异性扩增就一目了然了啊。引物不行就直接换引物了，  我说的对不对啊？？？ 在线等答案…………………………
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微生物小硕
1楼 2013-07-28 09:08:33
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-07-29 08:12:10
哥们。。。你的引物有问题是不能做荧光定量PCR的。好好重新设计引物，定量的引物还不好设计吗？设计好引物后利用普通PCR摸好退火温度和引物的量，然后再做实时荧光定量PCR。如果是半定量的话有二聚体也无所谓了。。 ...

关键是我已经做了好多次了   而且是  结果一次不如一次，，我觉得我直接上一次荧光 不就完了吗？ 就什么问题都解决了， 如果引物有二聚体，或者非特异性扩增，这些都能直接看出来啊， 那我就直接换引物了啊
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微生物小硕
6楼2013-07-29 08:56:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-28 16:04:40
我不知道你说的半定量条带不好是指有引物二聚体，或者是有其它非特异条带？如果你做半定量PCR时能看到引物二聚体，直接说明引物不好，根本不用试荧光定量。因为荧光定量非常灵敏，如果胶上能看到的话荧光肯定能检测到引物的熔解峰。如果有非特异条带，经优化退火温度仍然不能去掉，也说明引物不好，直接换引物。
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2楼2013-07-28 11:18:26
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-28 11:18:26
我不知道你说的半定量条带不好是指有引物二聚体，或者是有其它非特异条带？如果你做半定量PCR时能看到引物二聚体，直接说明引物不好，根本不用试荧光定量。因为荧光定量非常灵敏，如果胶上能看到的话荧光肯定能检测 ...

引物二聚体 倒不是很明显   有非特异性扩增，  目的条带非常的弱  只有内参特别亮！我觉得直接上荧光，引物行不行或者是其他什么问题，就可以直接知道了， 就不明白为什么还多此一举做个半定量，实在搞不懂？
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微生物小硕
3楼2013-07-28 17:08:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-07-28 17:08:11
引物二聚体 倒不是很明显   有非特异性扩增，  目的条带非常的弱  只有内参特别亮！我觉得直接上荧光，引物行不行或者是其他什么问题，就可以直接知道了， 就不明白为什么还多此一举做个半定量，实在搞不懂？...

半定量比较省钱，而且对PCR仪器没太多要求。如果有条件可以直接用荧光，先做个引物退火温度梯度，看熔解曲线的效果。
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4楼2013-07-28 23:09:59
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