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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重组蛋白不挂his柱
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qhs2011

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组蛋白不挂his柱

急求解决：我最近在纯化一个61K的蛋白，用PET32a/BL21的，在包涵体中表达，我用8M urea溶不掉，我就在里面加β-ME（1mM），好在是融了，但不挂NTA的柱子，求各位高见，本人不胜感激啊？我是用含20-500mM Imid 的Ttis-hcl 8.0 500mM Nacl 分布洗脱了，结果分析目标蛋白在流穿里面，而且比较纯……只是拿不到啊，我还专门用硫酸铵沉淀流穿，也拿不到（含有大量核酸），还有我纯化的另一个蛋白在上清里面（55k，表达量不高，），它是乎能和柱子结合（和之前挂不上的柱子是同一批买的），但也有问题：20-500mM Imid 的PBS 7.4 500mM Nacl 洗脱，目标蛋白在20, 100, 500mM Imid 洗脱液洗脱时出现，但杂蛋白很多，同求指导，万分焦急……
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1楼 2013-07-25 06:55:37
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你用β-ME（1mM）会破坏柱子上的Ni，当然会挂不住啊，我用8M urea溶解效果不错的，PH值在8.0，我清洗和洗脱都是用8M urea只是PH值不同分别为6和4。最后再用β-ME来复性。还有一点你用的柱子是哪个公司的，QIGEN公司会比较好，而且你可以考虑一下不同基质的柱子，现在的柱子有的是用树脂如（全式金）和琼脂糖（Invitrogen）。再者可以在破碎缓冲液中加入适量咪唑（20mM）,希望对你有用。
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成功，就是成为你想成为的人
3楼2013-08-05 10:40:02
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loudbing

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
2楼2013-08-05 10:17:50
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qhs2011

新虫 (初入文坛)
我用的是GE的NTA预装柱，我想问一下“清洗和洗脱都是用8M urea只是PH值不同分别为6和4”怎么理解？是包涵体洗涤用PH6.0的Urea,洗脱有PH4.0的Urea？小弟急求解哦
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4楼2013-08-12 08:53:26
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qhs2011

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by loudbing at 2013-08-05 10:17:50
挂不上柱子多数是标签没有暴露出来吧，试试分析一下his-tag的空间构型。可以试试放在前面或后面。
另外，还有一个可能。你的读码框应该没错吧？

his-tag的空间构型怎么分析啊？用软件吗？求您高见
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5楼2013-08-12 08:54:53
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