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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 梯度PCR退火温度
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duke188

新虫 (初入文坛)

[求助] 梯度PCR退火温度

上游TTACAAGATGGAGCCTCACC(GC含量50%)
Tm(1M Na+)：68.2
Tm(50mM Na+)：46.6
下游CAAAGAATAACCCAGGACGA(GC含量45%)
Tm(1M Na+)：66.2
Tm(50mM Na+)：44.6
顺便问下大家，Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)有什么区别啊?
我该选择哪个Tm啊？
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1楼 2013-07-21 21:38:26
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shangrila911

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
duke188(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-21 23:05:54
Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)  括号里面的表示盐浓度，盐浓度越高，Tm越高，不过还是根据自己的实际PCR情况而定，一般PCR常用Tm(50mM Na+)作参考...
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一切都会好的!
2楼2013-07-21 22:01:11
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duke188

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shangrila911 at 2013-07-21 22:01:11
Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)  括号里面的表示盐浓度，盐浓度越高，Tm越高，不过还是根据自己的实际PCR情况而定，一般PCR常用Tm(50mM Na+)作参考...

我是新手，由于要做梯度PCR摸退火温度，按照Tm(50mM Na+)--5℃的话，退火温度是不是太低了
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3楼2013-07-21 22:20:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-22 11:49:07
引用回帖:
3楼: Originally posted by duke188 at 2013-07-21 22:20:52
我是新手，由于要做梯度PCR摸退火温度，按照Tm(50mM Na+)--5℃的话，退火温度是不是太低了...

一般PCR时的退火温度很少选在50°C以下。从你的引物大概是20nt，GC含量在50%左右，退火温度一般在55-60°C。你可以根据这个设计你的温度梯度。
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4楼2013-07-22 04:27:58
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-22 11:49:12
根据你的序列，感觉你正向引物3端GC含量有点高，不过应该没有多大关系，直接做个50， 48,46的TD pcr就没问题！Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
5楼2013-07-22 05:31:19
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xz2001199802

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
eurofins给出你的引物Tm分别为57.3和55.3，所以我建议你用52 - 55°。我通常都是这么整的，应该没问题的
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越学越无知
6楼2013-07-22 18:31:43
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-23 08:21:20
PCR退火温度做梯度的话，一般采取从高于TM值10℃的温度开始，比如你的TM值是55℃那么你从65℃开始做梯度。另外可以坐下touch down试试，每个循环降0.7℃或者1℃，一般可以得到目的条带，我是这么做的，供你参考下
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不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…
7楼2013-07-22 18:37:31
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duke188

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xz2001199802 at 2013-07-22 18:31:43
eurofins给出你的引物Tm分别为57.3和55.3，所以我建议你用52 - 55°。我通常都是这么整的，应该没问题的

谢谢！DNA合成说明书上给的那些Tm没有用么
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8楼2013-07-22 22:41:20
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duke188

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hyc_charles at 2013-07-22 18:37:31
PCR退火温度做梯度的话，一般采取从高于TM值10℃的温度开始，比如你的TM值是55℃那么你从65℃开始做梯度。另外可以坐下touch down试试，每个循环降0.7℃或者1℃，一般可以得到目的条带，我是这么做的，供你参考下

谢谢！我们要摸出退火温度做定量PCR
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9楼2013-07-22 22:43:08
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xz2001199802

金虫 (正式写手)
应该有用，但是我之前我用的公司的合成引物没有这个信息，所以我也不知道你这个对退火温度的选择有什么作用
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越学越无知
10楼2013-07-22 22:46:16
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