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melisax

新虫 (初入文坛)

[求助] T4酶切连接求助!

最近在做酶切连接,我用的载体上的多克隆位点,SALI和HIND3酶切切开之后与目的片段连接,目的片段也是用同样的酶从T载上切下来的,载体和片段都做了胶回收也跑过胶看过亮度了,浓度还可以的,然后按1比10体系加,T4连接过夜。我做了好久了平板上一点也不长。确认酶什么的都是没有问题的别人做都很正常,感受态我也换过几次也不长,用商业化的感受态也不长,平板抗生素也都是没有问题的。现在抓狂了,到底问题出在哪里都不知道,求大神解答!谢谢!!!

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melisax

新虫 (初入文坛)

一开始我怀疑载体自连或者酶切不干净,可是这样也起码会长假阳性吧,可是我的平板就是空的什么都没有。我的片段测过序了,酶切位点没有问题。

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2楼2013-06-19 23:50:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
melisax(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-20 09:06:26
转化时要多做点对照便于分析。关于T4连接酶的对照,一般有载体双酶切自连、单酶切自连的对照。感受态的对照最好也做一下,就是转个同样抗性的质粒,确定转化步骤和操作没有问题。
3楼2013-06-20 00:47:38
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是呀!做不出来最好做一下对照!
试试超感吧

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4楼2013-06-20 06:05:29
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
melisax(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-26 12:28:02
既然这样,建议你尝试一下:
1. 分别以片段:载体的不同比例做2-3个体系同时连接;
2. 不知道你是多少度连接的?可以16度过夜转一次,剩下的继续放4度一段时间后再转
岂能尽如人意,但求无愧我心
5楼2013-06-20 09:56:42
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-26 12:28:14
我的感觉是T4可能出问题了,去其他实验室借1ul,试验一下就是了
★穷则独善其身,达则兼济天下★
6楼2013-06-20 11:04:27
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melisax

新虫 (初入文坛)

楼上说的对照啊酶啊这些问题都排除了。。。。。

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7楼2013-06-21 23:24:06
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melisax

新虫 (初入文坛)

可能是体系问题,我再试下吧。。。

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8楼2013-06-21 23:24:54
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xiaozhou0904

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-22 08:28:31
胶回收后要测dna回收到的浓度,然后做到绝对定量!链接的温度控制在16℃,过夜链接!
9楼2013-06-22 00:11:00
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xiaozhou0904

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

胶回收后要测dna回收到的浓度,然后做到绝对定量!链接的温度控制在16℃,过夜链接!
10楼2013-06-22 00:11:20
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