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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T4酶切连接求助！
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melisax

新虫 (初入文坛)

[求助] T4酶切连接求助！

最近在做酶切连接，我用的载体上的多克隆位点，SALI和HIND3酶切切开之后与目的片段连接，目的片段也是用同样的酶从T载上切下来的，载体和片段都做了胶回收也跑过胶看过亮度了，浓度还可以的，然后按1比10体系加，T4连接过夜。我做了好久了平板上一点也不长。确认酶什么的都是没有问题的别人做都很正常，感受态我也换过几次也不长，用商业化的感受态也不长，平板抗生素也都是没有问题的。现在抓狂了，到底问题出在哪里都不知道，求大神解答！谢谢！！！

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1楼 2013-06-19 23:48:32
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melisax

新虫 (初入文坛)
一开始我怀疑载体自连或者酶切不干净，可是这样也起码会长假阳性吧，可是我的平板就是空的什么都没有。我的片段测过序了，酶切位点没有问题。

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2楼2013-06-19 23:50:35
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melisax

新虫 (初入文坛)
楼上说的对照啊酶啊这些问题都排除了。。。。。

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7楼2013-06-21 23:24:06
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melisax

新虫 (初入文坛)
可能是体系问题，我再试下吧。。。

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8楼2013-06-21 23:24:54
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melisax

新虫 (初入文坛)
是16度过夜的啊

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11楼2013-06-22 11:28:37
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melisax

新虫 (初入文坛)
缓冲液也是新配制的，应该没有问题，我问过别人用的都挺正常的，还是应该是浓度问题吧。。。可是我按载体1.5 片段7 这么加应该够了吧，太浓了？

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13楼2013-06-23 09:48:53
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melisax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-25 22:51:32
你们过夜是怎么过的，我用PCR仪，但听说对仪器伤害大就没敢用了，但我做出来16摄氏度过夜确实效果最好...

不是有金属浴么？或者制冷水浴锅都可以

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15楼2013-06-25 23:14:24
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