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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序序列为载体序列怎么办
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陈正启

铁虫 (初入文坛)

[求助] 测序序列为载体序列怎么办

最近做基因克隆，已经确定P出基因了，但是在做连接转化送去测序过程中出现了问题，在送测之前做了菌液PCR验证，是有条带的，但是测序的结果都是载体序列。我没有用蓝白班筛选，以前没有用蓝白班筛选也能做出来的。想请教各位，这可能是什么原因呢，为什么挑出的克隆里都是假阳性。
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1楼 2013-06-13 16:51:38
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yhbletter

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你提取质粒，利用T载体两端的酶切位点和你插入片段的酶切位点，做一个酶切验证。菌落PCR有时会出现假阳性。
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2楼2013-06-13 17:08:46
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nobodykqq

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励发帖应助！ 2013-06-13 18:43:19
菌液PCR出现假阳性很正常，你可以同时做1个阳性对照（目的基因为模板）、1个阴性对照（水为模板），以确定是不是由于你的PCR试剂受到污染所致。其实一般菌P都是没什么问题的，你这个现象属于少见。一旦出现这种现象，建议你从头开始重做，一步一步仔细的完成，送测序前提取质粒后酶切鉴定，鉴定重组载体是否构建成功的双保险（菌P和双酶切），二者都成功那么你的载体也就准确无误的构建成功了。
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拒绝平庸，追求卓越！
3楼2013-06-13 17:40:14
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