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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双向测序序列拼接不起来
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sinky熹

铜虫 (初入文坛)

[求助] 双向测序序列拼接不起来

偷懒直接用的PCR产物测序，测序结果告诉我双向测序成功，但是序列拼接不起来，而且看峰图，应该是非特异性带，产物大小居然接近我的目的产物，很费解，因为电泳图中虽然有些二聚体，但也是很小的，几十bp最多了。。求讲解，，
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1楼 2013-04-02 21:50:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sinky熹: 金币+4 2013-04-03 09:53:18
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 23:09:23
拼接不起来是指两个引物测出的序列不能拼成一个分子？那你如何知道产物大小的？我觉得可能是PCR的时候P出的可能是分子量与目的条带接近的其他分子，有可能是PCR体系污染了。
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2楼2013-04-02 22:54:10
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sinky熹: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-04-03 09:53:07
把你测序获得序列放在NCBI里面blast看看是什么序列。
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3楼2013-04-03 01:06:08
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sinky熹

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-02 22:54:10
拼接不起来是指两个引物测出的序列不能拼成一个分子？那你如何知道产物大小的？我觉得可能是PCR的时候P出的可能是分子量与目的条带接近的其他分子，有可能是PCR体系污染了。

是的，我用cap3拼不成一个分子。因为相同产物其他测出来了，跟我的目的带很近，所以我推测应该是在这个上下。
我是做浓度梯度的时候跑出了个很奇怪的图，浓度高，片段偏小，所以拿去测个序。。
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4楼2013-04-03 09:24:53
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sinky熹

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-03 01:06:08
把你测序获得序列放在NCBI里面blast看看是什么序列。

显示后半段和我的模版匹配，但匹配率也不高，81%
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5楼2013-04-03 09:33:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
sinky熹: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-04-03 09:52:55
引用回帖:
4楼: Originally posted by sinky熹 at 2013-04-03 09:24:53
是的，我用cap3拼不成一个分子。因为相同产物其他测出来了，跟我的目的带很近，所以我推测应该是在这个上下。
我是做浓度梯度的时候跑出了个很奇怪的图，浓度高，片段偏小，所以拿去测个序。。...

问题可能出在最初PCR上。试试重新制备模板稀释引物再P一下看看。
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6楼2013-04-03 09:36:13
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sinky熹

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-03 09:36:13
问题可能出在最初PCR上。试试重新制备模板稀释引物再P一下看看。...

试过引物普通10p浓度是可以扩出目的带的。最初PCR，，，你是说我那次做的模版或者引物可能有问题么，，，
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7楼2013-04-03 09:41:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sinky熹 at 2013-04-03 09:41:10
试过引物普通10p浓度是可以扩出目的带的。最初PCR，，，你是说我那次做的模版或者引物可能有问题么，，，...

有可能是的。你说其它的克隆可以测序拼接成功，我觉得可能是P这个片段的时候出了问题，最好重新P一下。
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8楼2013-04-04 02:48:32
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希罗雅

银虫 (小有名气)
可能是非特异性扩增
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凡事学习
9楼2014-06-03 14:12:15
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