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sinky熹

铜虫 (初入文坛)

[求助] 双向测序序列拼接不起来

偷懒直接用的PCR产物测序,测序结果告诉我双向测序成功,但是序列拼接不起来,而且看峰图,应该是非特异性带,产物大小居然接近我的目的产物,很费解,因为电泳图中虽然有些二聚体,但也是很小的,几十bp最多了。。求讲解,,
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sinky熹: 金币+4 2013-04-03 09:53:18
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-31 23:09:23
拼接不起来是指两个引物测出的序列不能拼成一个分子?那你如何知道产物大小的?我觉得可能是PCR的时候P出的可能是分子量与目的条带接近的其他分子,有可能是PCR体系污染了。
2楼2013-04-02 22:54:10
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sinky熹: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-04-03 09:53:07
把你测序获得序列放在NCBI里面blast看看是什么序列。
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-04-03 01:06:08
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sinky熹

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-02 22:54:10
拼接不起来是指两个引物测出的序列不能拼成一个分子?那你如何知道产物大小的?我觉得可能是PCR的时候P出的可能是分子量与目的条带接近的其他分子,有可能是PCR体系污染了。

是的,我用cap3拼不成一个分子。因为相同产物其他测出来了,跟我的目的带很近,所以我推测应该是在这个上下。
我是做浓度梯度的时候跑出了个很奇怪的图,浓度高,片段偏小,所以拿去测个序。。
4楼2013-04-03 09:24:53
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sinky熹

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-03 01:06:08
把你测序获得序列放在NCBI里面blast看看是什么序列。

显示后半段和我的模版匹配,但匹配率也不高,81%
5楼2013-04-03 09:33:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
sinky熹: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-04-03 09:52:55
引用回帖:
4楼: Originally posted by sinky熹 at 2013-04-03 09:24:53
是的,我用cap3拼不成一个分子。因为相同产物其他测出来了,跟我的目的带很近,所以我推测应该是在这个上下。
我是做浓度梯度的时候跑出了个很奇怪的图,浓度高,片段偏小,所以拿去测个序。。...

问题可能出在最初PCR上。试试重新制备模板稀释引物再P一下看看。
6楼2013-04-03 09:36:13
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sinky熹

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-03 09:36:13
问题可能出在最初PCR上。试试重新制备模板稀释引物再P一下看看。...

试过引物普通10p浓度是可以扩出目的带的。最初PCR,,,你是说我那次做的模版或者引物可能有问题么,,,
7楼2013-04-03 09:41:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sinky熹 at 2013-04-03 09:41:10
试过引物普通10p浓度是可以扩出目的带的。最初PCR,,,你是说我那次做的模版或者引物可能有问题么,,,...

有可能是的。你说其它的克隆可以测序拼接成功,我觉得可能是P这个片段的时候出了问题,最好重新P一下。
8楼2013-04-04 02:48:32
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希罗雅

银虫 (小有名气)

可能是非特异性扩增
凡事学习
9楼2014-06-03 14:12:15
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