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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆的问题
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)

[求助] TA克隆的问题

我的目的条带是785bp，拿目的条带与pTG19-T连接后转化感受态细胞，进行菌液PCR时，条带都500bp以下，用M13通用引物做PCR发现不是没有连接上，只是连接的片段很短，不知道是哪里出了问题？
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1楼 2013-05-10 12:44:32
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-05-10 18:49:31
liuxiuaza: 金币+1 2013-05-13 11:07:03
你能确定你的目的条带是785bp??
以什么为模板扩增的?

少了只能说你的目的条带785bp可能是错误的.
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2楼2013-05-10 14:18:29
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xiemin217

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-10 22:50:39
liuxiuaza: 金币+3, 已经反复做过了，还是不行的 2013-05-13 11:07:24
给你个建议，如果你几次都是这样，从PCR开始把PCR所以东西换成新的，再做一次。
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3楼2013-05-10 15:09:06
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lihaiyan0208

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza: 金币+1 2013-05-13 11:09:43
liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:50:25
你可能是胶回收的时候，可能紫外照射时间过长，导致片段断裂，你试下看胶回收时注意下紫外照射时间尽量短些。还有你用M13检测的话应该是只能检测是否连接上片段吧，你能确定连接上的就是你的目的片段，而不是杂带。你挑了多少也菌斑检测啊，你可以试着多挑一些试试，我当时也有这种情况，后来多挑几个就发现正确的目的条带了。
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4楼2013-05-10 23:08:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza: 金币+1 2013-05-13 11:09:49
目的片段回收后是否跑胶验证，确定是785bp？
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5楼2013-05-11 07:04:21
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liyu0355 at 2013-05-10 14:18:29
你能确定你的目的条带是785bp??
以什么为模板扩增的?

少了只能说你的目的条带785bp可能是错误的.

利用基因组DNA扩增的目的片段，后来又利用PCR产物进行了PCR，确定是700-800bp的片段
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6楼2013-05-13 11:06:58
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lihaiyan0208 at 2013-05-10 23:08:13
你可能是胶回收的时候，可能紫外照射时间过长，导致片段断裂，你试下看胶回收时注意下紫外照射时间尽量短些。还有你用M13检测的话应该是只能检测是否连接上片段吧，你能确定连接上的就是你的目的片段，而不是杂带。 ...

我总过挑了130个菌落了，要么没有条带，要么就是条带大小不正确，郁闷呐
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7楼2013-05-13 11:08:38
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-11 07:04:21
目的片段回收后是否跑胶验证，确定是785bp？

是的，确定是700-800bp的片段
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8楼2013-05-13 11:09:04
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rth1983

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuxiuaza(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-13 12:50:39
有可能是连接前DNA片段断裂，也有可能是你的DNA片段和你的载体中间有些问题，可以换一种载体试试
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9楼2013-05-13 11:35:26
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
liuxiuaza: 金币+1 2013-05-14 15:19:39
测序或者提完质粒后PCR
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在这个纷绕的世俗世界里，能够学会用一颗平常的心去对待周围的一切，也是一种境界。
10楼2013-05-13 13:33:47
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