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zg1415

金虫 (正式写手)

[求助] TA克隆问题 求助~~

最近TA克隆两个片段,大小分别为2kb和3.2kb,分别为下图左边6个和右边6个,中间和最后分别是λ/Hind 3和Marker 3,求分析转化子提质粒的电泳图,转进去了吗? 个人感觉电泳图很奇怪~ 谢谢 !

2013.1.18.JPG
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一直被模仿,从未被超越
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chenfeng0519

金虫 (著名写手)

顶一个
2楼2013-01-19 18:09:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用的什么T-载体?因为质粒超螺旋构象跑得比同分子量的marker快,最好做个单酶切确定质粒大小。
3楼2013-01-19 18:28:54
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zg1415

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-19 18:28:54
用的什么T-载体?因为质粒超螺旋构象跑得比同分子量的marker快,最好做个单酶切确定质粒大小。

pMD18T simple 用的东西应该都没问题,以前从未遇到过,都是一次成功~
一直被模仿,从未被超越
4楼2013-01-19 21:05:00
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oldflying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
没用空白质粒比较下?加一个空白质粒作对照就知道了,看左边和右边条带位置差不多,可能有问题啊。
一个人的努力和坚持!
5楼2013-01-19 21:12:19
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有没有连接成功,你可以转化了之后使用M13引物筛克隆呀
6楼2013-01-19 21:37:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zg1415 at 2013-01-19 21:05:00
pMD18T simple 用的东西应该都没问题,以前从未遇到过,都是一次成功~...

用载体通用引物做菌落PCR筛一下。
7楼2013-01-20 01:30:48
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x_iao_le

银虫 (小有名气)

你这胶用的有点浪费啊
8楼2013-01-20 10:25:11
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
卤煮上样比质粒大小的时候,由于质粒闭合环状结构造成超螺旋,所以线性分子的DNA马克是无法判断大小的,为此必须上的对照是你所连载体的空载,作为负对照。
若所选克隆跑琼脂糖胶大小比空载大,可暂且判断有片段连入载体。
想进一步判断,则需做PCR验证,做两个平行,一组是测序引物,一组是所连基因合成时候的首尾引物,若两者大小和预期一致,则基本可以判断连入片段为目的基因。
可加入酶切验证。
测序是最保险的验证方法,没有之一,PCR验证正确后,测序不失为好的手段。

祝实验顺利:)
9楼2013-01-20 10:47:03
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heismeng

金虫 (小有名气)

顶9楼~全面~
10楼2013-01-22 15:43:29
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