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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆问题 求助~~
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zg1415

金虫 (正式写手)

[求助] TA克隆问题 求助~~

最近TA克隆两个片段，大小分别为2kb和3.2kb,分别为下图左边6个和右边6个，中间和最后分别是λ/Hind 3和Marker 3，求分析转化子提质粒的电泳图，转进去了吗？ 个人感觉电泳图很奇怪~ 谢谢 ！

2013.1.18.JPG
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一直被模仿，从未被超越
1楼 2013-01-19 17:45:27
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chenfeng0519

金虫 (著名写手)
顶一个
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2楼2013-01-19 18:09:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的什么T-载体？因为质粒超螺旋构象跑得比同分子量的marker快，最好做个单酶切确定质粒大小。
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3楼2013-01-19 18:28:54
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zg1415

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-19 18:28:54
用的什么T-载体？因为质粒超螺旋构象跑得比同分子量的marker快，最好做个单酶切确定质粒大小。

pMD18T simple 用的东西应该都没问题，以前从未遇到过，都是一次成功~
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一直被模仿，从未被超越
4楼2013-01-19 21:05:00
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oldflying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没用空白质粒比较下？加一个空白质粒作对照就知道了，看左边和右边条带位置差不多，可能有问题啊。
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一个人的努力和坚持！
5楼2013-01-19 21:12:19
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有没有连接成功，你可以转化了之后使用M13引物筛克隆呀
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6楼2013-01-19 21:37:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by zg1415 at 2013-01-19 21:05:00
pMD18T simple 用的东西应该都没问题，以前从未遇到过，都是一次成功~...

用载体通用引物做菌落PCR筛一下。
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7楼2013-01-20 01:30:48
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x_iao_le

银虫 (小有名气)
你这胶用的有点浪费啊
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8楼2013-01-20 10:25:11
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
卤煮上样比质粒大小的时候，由于质粒闭合环状结构造成超螺旋，所以线性分子的DNA马克是无法判断大小的，为此必须上的对照是你所连载体的空载，作为负对照。
若所选克隆跑琼脂糖胶大小比空载大，可暂且判断有片段连入载体。
想进一步判断，则需做PCR验证，做两个平行，一组是测序引物，一组是所连基因合成时候的首尾引物，若两者大小和预期一致，则基本可以判断连入片段为目的基因。
可加入酶切验证。
测序是最保险的验证方法，没有之一，PCR验证正确后，测序不失为好的手段。

祝实验顺利：）
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9楼2013-01-20 10:47:03
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heismeng

金虫 (小有名气)
顶9楼~全面~
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10楼2013-01-22 15:43:29
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