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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by liuxiuaza at 2013-05-13 11:09:04
是的，确定是700-800bp的片段...

那只能说是没有连进去。确定T载体还好用吗？T载体放时间长了会发生自连，转一下空T载体试试。
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11楼2013-05-14 07:35:42
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xuqingchun33 at 2013-05-13 13:33:47
测序或者提完质粒后PCR

提了质粒测序了，结果是插入片段是目的片段的一部分。
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12楼2013-05-14 15:20:14
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by rth1983 at 2013-05-13 11:35:26
有可能是连接前DNA片段断裂，也有可能是你的DNA片段和你的载体中间有些问题，可以换一种载体试试

连接前断裂的话，也不知道是哪一步断了，做了三次都是一样的结果。这次实验是和其他目的片段一块做的，用同样的载体，结果都很好，测序结果也正确，只有这个片段长一点的做不出来。
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13楼2013-05-14 15:21:57
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-14 07:35:42
那只能说是没有连进去。确定T载体还好用吗？T载体放时间长了会发生自连，转一下空T载体试试。...

确定载体是好用的，因为同时做的其他样品是没有问题的。我拿菌液做了中抽，质粒拿出去测序，结果是插入片段是目的片段的一部分。不知道是什么原因啊？你有没有遇到过这种现象啊？
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14楼2013-05-14 15:24:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
14楼: Originally posted by liuxiuaza at 2013-05-14 15:24:04
确定载体是好用的，因为同时做的其他样品是没有问题的。我拿菌液做了中抽，质粒拿出去测序，结果是插入片段是目的片段的一部分。不知道是什么原因啊？你有没有遇到过这种现象啊？...

没有遇到过这种情况。可能是目的片段回收过程中断裂。你试试再做一次。
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15楼2013-05-15 07:27:44
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lihaiyan0208

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liuxiuaza at 2013-05-13 11:06:58
利用基因组DNA扩增的目的片段，后来又利用PCR产物进行了PCR，确定是700-800bp的片段...

我觉得你还是重新连接一下吧，有可能你的目的片段根本没连接上去，注意下连接时间不要过长或过短，这都会影响你的连接的，还有你PCR检测的时候也可以用你自己的引物检测下，这样确保连接检测出来的肯定是你的目的片段
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16楼2013-05-16 15:38:37
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饿的神啊

新虫 (著名写手)
我也遇到了这样的问题，1000bp左右的条带，用的通用引物检测，载体199bp，可是检测发现大部分条带都只有300bp和500bp，很是郁闷。
LZ的问题有没有解决啊？
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17楼2013-06-07 15:21:00
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2013-06-07 15:21:00
我也遇到了这样的问题，1000bp左右的条带，用的通用引物检测，载体199bp，可是检测发现大部分条带都只有300bp和500bp，很是郁闷。
LZ的问题有没有解决啊？

没有解决，我后来又拿去测序了一下，插入片段是目的条带的一部分，然后又对引物进行BLAST，说是引物特异性不好，有多个结合位点，但是PCR时条带大小正确，这个又没办法解释了。我现在也是稀里糊涂的
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18楼2013-06-07 17:04:13
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