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求助PCR产物酶切问题
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我的产物是243bp和144bp的小片段,PCR出来条带很亮,我是用总100ul的体积,然后全部胶回收,最后回收到60~70ul.再去电泳检测亮度还是不错的. 现在要进行双酶切,我P的时候两头加了酶切位点,还有3个保护碱基,用的是ECoR I Xba I. 都是takara的酶. 由于我没办法测浓度,因为空白对照的ELLUTE BUFFER 不够了. 这样一般要加多少ul. 说明书写得是20ul的体积,切1个小时.如果我后期要载体连接,载体是5700+bp的这样我应该要有多少的含量才够呢? 我们实验室有个紫外投射仪上面有个功能是根据marker亮度还有你自己产物的亮度跑出来以后可以估算你产物浓度的.这个准不准呢? |
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cicelyzh
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【答案】应助回帖
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| 你是用nanodrop定量的吗？不用elute buffer直接用水做空白也可以的。此外，你可以根据电泳检测时的亮度对比marker的相应条带估算浓度。小片段与载体连接一般用6-10:1的摩尔比。一般连接时载体用50ng，你根据碱基数目计算所需要目的片段的质量。总的来说，连接所用的DNA是很少的，一般都是在几十ng级别的。一般小片段回收的损失比较多，一般酶切用1-2μg是足够的。 |
2楼2013-04-25 14:32:06
3楼2013-04-25 18:11:07
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cicelyzh
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5楼2013-04-26 08:53:13
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