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xjtu0025

新虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR产物酶切问题

我的产物是243bp和144bp的小片段,PCR出来条带很亮,我是用总100ul的体积,然后全部胶回收,最后回收到60~70ul.再去电泳检测亮度还是不错的.

现在要进行双酶切,我P的时候两头加了酶切位点,还有3个保护碱基,用的是ECoR I Xba I. 都是takara的酶.
由于我没办法测浓度,因为空白对照的ELLUTE BUFFER 不够了.
这样一般要加多少ul.

说明书写得是20ul的体积,切1个小时.如果我后期要载体连接,载体是5700+bp的这样我应该要有多少的含量才够呢?

我们实验室有个紫外投射仪上面有个功能是根据marker亮度还有你自己产物的亮度跑出来以后可以估算你产物浓度的.这个准不准呢?
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1楼 2013-04-25 14:08:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xjtu0025(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-25 16:56:53
你是用nanodrop定量的吗？不用elute buffer直接用水做空白也可以的。此外，你可以根据电泳检测时的亮度对比marker的相应条带估算浓度。小片段与载体连接一般用6-10:1的摩尔比。一般连接时载体用50ng，你根据碱基数目计算所需要目的片段的质量。总的来说，连接所用的DNA是很少的，一般都是在几十ng级别的。一般小片段回收的损失比较多，一般酶切用1-2μg是足够的。
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2楼2013-04-25 14:32:06
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-25 14:32:06
你是用nanodrop定量的吗？不用elute buffer直接用水做空白也可以的。此外，你可以根据电泳检测时的亮度对比marker的相应条带估算浓度。小片段与载体连接一般用6-10:1的摩尔比。一般连接时载体用50ng，你根据碱基数目 ...

我用了仅剩下一点的洗脱液去测,5个样品,其中两个A340那里是负数..还有基本盐浓度都超标....我乙醇洗脱了4次...难道我PCR完以后不应该进行胶回收,纯化就好了么?我没有非特异性条带
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3楼2013-04-25 18:11:07
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励应助！ 2013-04-25 21:28:56
本帖内容被屏蔽
4楼2013-04-25 19:48:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-25 18:11:07
我用了仅剩下一点的洗脱液去测,5个样品,其中两个A340那里是负数..还有基本盐浓度都超标....我乙醇洗脱了4次...难道我PCR完以后不应该进行胶回收,纯化就好了么?我没有非特异性条带...

PCR如果只有一条带而且没有明显的引物二聚体，一般是可以直接纯化的。
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5楼2013-04-26 08:53:13
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