应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助PCR产物酶切问题
51/1返回列表
查看: 863  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xjtu0025

新虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR产物酶切问题

我的产物是243bp和144bp的小片段,PCR出来条带很亮,我是用总100ul的体积,然后全部胶回收,最后回收到60~70ul.再去电泳检测亮度还是不错的.

现在要进行双酶切,我P的时候两头加了酶切位点,还有3个保护碱基,用的是ECoR I Xba I. 都是takara的酶.
由于我没办法测浓度,因为空白对照的ELLUTE BUFFER 不够了.
这样一般要加多少ul.

说明书写得是20ul的体积,切1个小时.如果我后期要载体连接,载体是5700+bp的这样我应该要有多少的含量才够呢?

我们实验室有个紫外投射仪上面有个功能是根据marker亮度还有你自己产物的亮度跑出来以后可以估算你产物浓度的.这个准不准呢?
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-04-25 14:08:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xjtu0025(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-25 16:56:53
你是用nanodrop定量的吗？不用elute buffer直接用水做空白也可以的。此外，你可以根据电泳检测时的亮度对比marker的相应条带估算浓度。小片段与载体连接一般用6-10:1的摩尔比。一般连接时载体用50ng，你根据碱基数目计算所需要目的片段的质量。总的来说，连接所用的DNA是很少的，一般都是在几十ng级别的。一般小片段回收的损失比较多，一般酶切用1-2μg是足够的。
赞一下 回复此楼
2楼2013-04-25 14:32:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-25 14:32:06
你是用nanodrop定量的吗？不用elute buffer直接用水做空白也可以的。此外，你可以根据电泳检测时的亮度对比marker的相应条带估算浓度。小片段与载体连接一般用6-10:1的摩尔比。一般连接时载体用50ng，你根据碱基数目 ...

我用了仅剩下一点的洗脱液去测,5个样品,其中两个A340那里是负数..还有基本盐浓度都超标....我乙醇洗脱了4次...难道我PCR完以后不应该进行胶回收,纯化就好了么?我没有非特异性条带
赞一下 回复此楼
3楼2013-04-25 18:11:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panyuzhu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励应助！ 2013-04-25 21:28:56
本帖内容被屏蔽
4楼2013-04-25 19:48:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-04-25 18:11:07
我用了仅剩下一点的洗脱液去测,5个样品,其中两个A340那里是负数..还有基本盐浓度都超标....我乙醇洗脱了4次...难道我PCR完以后不应该进行胶回收,纯化就好了么?我没有非特异性条带...

PCR如果只有一条带而且没有明显的引物二聚体，一般是可以直接纯化的。
赞一下 回复此楼
5楼2013-04-26 08:53:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xjtu0025 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭