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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

[求助] 为什么荧光定量PCR扩增曲线呈倒S型 已有2人参与

图是我做的荧光定量PCR扩增曲线,两条线是一模一样的样品跑出来的,但是一个就是正常的S型曲线,一个就是倒S型的.我用的TaqMan探针.这样的结果出现很多次了,就是不知道问题出哪儿了,所以来求助了.

未命名.jpg
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保持平常心❤
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

木有人看吗
保持平常心❤
2楼2013-04-10 20:50:25
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yiloutingyu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yucuiyuan00(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-11 08:20:15
yucuiyuan00: 金币+2 2013-04-12 08:22:23
我做过一些,我认为主要是你的质粒的浓度不一样,你把质粒浓度稀释成相同拷贝数的试试。
3楼2013-04-10 22:11:37
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yiloutingyu at 2013-04-10 22:11:37
我做过一些,我认为主要是你的质粒的浓度不一样,你把质粒浓度稀释成相同拷贝数的试试。

是同一管稀释好的加样的啊
保持平常心❤
4楼2013-04-11 08:47:27
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yucuiyuan00: 金币+2, 我用的八联管 用振荡器混匀的了 而且都离心下来了 因为我每次离心好了都看下的 2013-04-12 08:22:11
yucuiyuan00(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-10 12:15:24
一开始那里翘起来可能是加样没混匀或者加样后离心没下去造成的,你可以再确定一下是不是这个原因
你的日子如何,你的力量也必如何!
5楼2013-04-11 16:02:54
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love_st

金虫 (著名写手)


不敢确定是什么原因,但是,你可以重复10管看看,或者做个梯度下去
6楼2013-04-11 16:49:06
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 专家考核, 专家辛苦了 2013-04-11 17:17:57
yucuiyuan00: 金币+10, ★有帮助, 提高阈值线了 两个重复的Ct值会差太多 这杨做肯定不行 我做过熔解曲线 引物没有二聚体 不过谢谢你的回答 2013-04-12 08:28:37
这不是倒s,而是s的前段放大了看就是这个效果,前面这个峰可以通过提高阈值(软件设置)压下去,
循环数太大可以通过稀释你的模板搞定,没有溶解曲线,不知道你的引物怎么样,不过估计也不会太好,可以另外设计一对新引物
7楼2013-04-11 16:58:53
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yiloutingyu

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by yucuiyuan00 at 2013-04-11 08:47:27
是同一管稀释好的加样的啊...

那你再重做试试,充分混匀 然后将ct值稍微调小一些。你确信你的荧光信号没问题?
8楼2013-04-11 22:38:42
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by yiloutingyu at 2013-04-11 22:38:42
那你再重做试试,充分混匀 然后将ct值稍微调小一些。你确信你的荧光信号没问题?...

我的扩增曲线荧光值一直很低 我觉得可能是仪器的原因 因为我PCR好了之后 用酶标仪测过荧光值 很高的
保持平常心❤
9楼2013-04-12 08:32:36
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ybQuan

金虫 (著名写手)

★
yucuiyuan00(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-10 12:16:11
可能有原因有:
模板浓度不一样,而且样品浓度量偏大导致抑制反应,S曲线没有起来——将两个样品DNA浓度测一下,稀释到相同浓度。
体系配比不对,各成分没有充分混匀;加样后没有离心——保证加样成分准确,并在加完样后离心。
哥在江湖漂,很少不挨刀,不是愿意挨,是哥很无奈!
10楼2013-04-12 10:53:23
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