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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

[求助] 为什么荧光定量PCR扩增曲线呈倒S型 已有2人参与

图是我做的荧光定量PCR扩增曲线,两条线是一模一样的样品跑出来的,但是一个就是正常的S型曲线,一个就是倒S型的.我用的TaqMan探针.这样的结果出现很多次了,就是不知道问题出哪儿了,所以来求助了.

未命名.jpg
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

木有人看吗
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2楼2013-04-10 20:50:25
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

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3楼: Originally posted by yiloutingyu at 2013-04-10 22:11:37
我做过一些,我认为主要是你的质粒的浓度不一样,你把质粒浓度稀释成相同拷贝数的试试。

是同一管稀释好的加样的啊
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4楼2013-04-11 08:47:27
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

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8楼: Originally posted by yiloutingyu at 2013-04-11 22:38:42
那你再重做试试,充分混匀 然后将ct值稍微调小一些。你确信你的荧光信号没问题?...

我的扩增曲线荧光值一直很低 我觉得可能是仪器的原因 因为我PCR好了之后 用酶标仪测过荧光值 很高的
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9楼2013-04-12 08:32:36
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

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10楼: Originally posted by ybQuan at 2013-04-12 10:53:23
可能有原因有:
模板浓度不一样,而且样品浓度量偏大导致抑制反应,S曲线没有起来——将两个样品DNA浓度测一下,稀释到相同浓度。
体系配比不对,各成分没有充分混匀;加样后没有离心——保证加样成分准确,并在加 ...

模板都是同一管稀释好的加的 震荡离心 我这个都注意了 应该不是这里的问题 最大的问题就是 这是两个一模一样的体系啊……
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11楼2013-04-12 12:36:45
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

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6楼: Originally posted by love_st at 2013-04-11 16:49:06
不敢确定是什么原因,但是,你可以重复10管看看,或者做个梯度下去

我重复过3管 但是就会有2管有问题
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12楼2013-04-12 12:40:29
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

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13楼: Originally posted by love_st at 2013-04-12 12:49:05
搞不明白,从试剂或者仪器上面找找找原因,有没有做过比这高浓度模板的重复呢...

仪器是伯乐的CFX-96 只有这一台仪器 高模板浓度的也会出现这种问题
保持平常心❤
14楼2013-04-12 13:39:29
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

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15楼: Originally posted by ybQuan at 2013-04-12 16:31:15
有没有测过模板浓度有多大?你用的是什么公司试剂,看图有点像是ABI的机器。
再仔细想想吧,总是有原因的吧...

我用伯乐的CEX-96 应该是模板的问题 我再试试吧
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18楼2013-04-13 22:55:21
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)

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20楼: Originally posted by 5utr at 2013-05-10 12:10:14
楼上都是乱说,这个曲线典型的原因就是两条引物退火温度差别太大,换个软件测试下退火温度,相差不到两度后就好了。

生工合成的引物 他们的软件计算的Tm值 跟我用oligo预测的还是有差别的 PS:你不是应助回帖 我没有办法给你金币……
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21楼2013-05-11 10:53:26
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