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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接后酶切检测遇到的问题
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auliuym

木虫 (著名写手)

[求助] 连接后酶切检测遇到的问题

请教各位分子生物学大德诸君：
  我将目的基因插到PET15b中，然后转入DH5a菌株中，再提取质粒、酶切跑胶检测，结果如下图所示：

左边是Marker，下面的胶是未酶切前，上面的是酶切后，泳道从左至右一一对应。可以看出，第3、5、8泳道，经过酶切后出现两条带，上一条应当是质粒，下一条是目的DNA片段，为什么这三个中的质粒条带与第2、4、6、7、9、10中的质粒条带位置不一样？是超螺旋结果的质粒吗？同理，可以看见在下面一块胶中第5、8的质粒条带与其他泳道的不同？为什么？
望大德诸君不啬赐教，不胜感激！！！有经验者，回答此问题，并很有说服力，将有金币奉上。

20130326.jpg
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日月逝矣，岁不我与。
1楼 2013-03-26 17:12:40
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auliuym

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小科研女dow at 2013-03-26 17:24:59
自我觉得 2467910的结果是正确的
切后是跑的慢了 理论上将应是单条带
可见你的没有切完全
下面的结果可能是提权过程的问题
出现了资解旋等问题

3、5、8如果没有切完全的话，最上面也应该有一条条带，即线状的质粒，也就是说应该有三条啊。
再，可以从下图看出来，3、5、8质粒本身也显示出比较小，跑得快？为什么？
若解螺旋了，应当跑得慢才是啊。
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日月逝矣，岁不我与。
3楼2013-03-26 17:46:16
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小科研女dow

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
auliuym: 金币+10, ★有帮助 2013-03-26 21:34:11
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-27 13:41:43
自我觉得 2467910的结果是正确的
切后是跑的慢了 理论上将应是单条带
可见你的没有切完全
下面的结果可能是提权过程的问题
出现了资解旋等问题
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做出色的科研人
2楼2013-03-26 17:24:59
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-03-27 13:41:54
从你的图上看，第2、5、8三个和其他的不一样，从酶切图看也是这样，但是切下来的片段大小是一样的，所以可能是载体不一样，也就是2、5、8和其他的是不同的载体，连的目的基因是一样的。
载体不一样可能有两个原因：一是载体本身发生了变异，如片段缺失，这个可能性不大，另一个就是载体污染，混入了其他载体。
我的建议是用载体上其他的酶切位点对应的两种酶切了试试，如果有的能切开而有的切不开，就说明是载体出了问题。
另外，你要是赶进度，可以这样处理：你用的载体大小应该知道的，用那个正确的往下做就OK啦，反正双酶切验证是正确的。
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没有做不到，只有想不到！
4楼2013-03-27 10:14:15
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
auliuym: 金币+40, ★★★★★最佳答案 2013-03-27 19:46:08
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王平阳 at 2013-03-27 10:14:15
从你的图上看，第2、5、8三个和其他的不一样，从酶切图看也是这样，但是切下来的片段大小是一样的，所以可能是载体不一样，也就是2、5、8和其他的是不同的载体，连的目的基因是一样的。
载体不一样可能有两个原因： ...

还有，你最后一个泳道插入的不是目的基因（你的目的基因2000多呢），而是介于250到500bp之间的一个小片段，不可用哦！
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没有做不到，只有想不到！
5楼2013-03-27 10:18:18
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