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]overlap PCR做不出来
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小虫做重叠pcr连接两个片段 1、分别扩增两个片段，退火温度为60 大小为945bp 950bp 纯化后备用 2、以纯化后的两个片段为模板，以前面片段的5‘端引物和后面片段的3’端引物来进行重叠PCR。重叠区24bp .第一次连接上了退火温度60，可之后怎么也连不上了，也做退火梯度，模板也稀释做过梯度了，酶也换过了，怎么办？ 体系是：50ul Buffer 5 条件是：初始变性 95 6min dNTP（10mM） 4 变性 98 30s primerA 1 退火 58/60 30s primerB 1 延伸 72 30s TemplateA 1.5 25cycle templateB 1.5 最终延伸 72 10min Enzyme tag-T 1 |
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Renavatio
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