24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 2096  |  回复: 12

viki_MDK

银虫 (正式写手)

[求助] 关于镍柱纯化,急求,!!

真是太怪异了。
我用大肠杆菌表达了一个可溶性蛋白,经质粒测序,序列都是没问题的,,这个可溶性蛋白我用镍柱纯化,,细菌破碎后,,上清液我过镍柱,,经过淋洗后用高浓度咪唑洗脱,洗脱下来后浓缩,,然后SDS-PAGE检测,,发现 没有我的目的蛋白,而是大肠杆菌自身蛋白,,这是怎么回事?
这个情况我碰到两次了,,上次一个蛋白也是这种情况,,用镍柱纯化的蛋白不是我的目的蛋白,,,真是怪异,,急求!!!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:57:55
amisking: 回帖置顶 2013-01-07 20:43:20
大肠杆菌的本底表达有些也是会与Ni-column结合的,这个正常。
我觉得主要还是要先确定是否有目的蛋白表达,然后再来考虑后续的纯化,
质粒转化至宿主菌后,目的蛋白能否表达受到很多因素的影响,不是序列正确了就一定有表达。
小兵一个
9楼2013-01-07 08:59:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

viki_MDK

银虫 (正式写手)

大家有碰到过这种情况吗
2楼2013-01-05 22:06:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
没纯化的总蛋白是否有目的蛋白呢?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-01-05 23:57:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:57:37
把诱导前的样品和诱导后的样品对比,确定诱导出的蛋白分子量正确。再把诱导的样品做全蛋白和可溶蛋白比较,确定蛋白是否真的在可溶部分。纯化时每个组(上柱前,flow through,wash,elute)分预留样品,做Western分析,确定纯化步骤中没有把目的蛋白丢失。
4楼2013-01-06 02:02:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:57:45
前面的那位说的不错!
你这个目的是不是真的有表达,你也没有验证!序列正确是一方面,你还是要看诱导表达之后,sds-page检测一下是否有你的目的蛋白表达!
其二,很可能你的破菌上清中就没有目的蛋白!目的蛋白在你的破菌沉淀中!可能原因有可能是选择的buffer pH不合适,或者破菌条件需要调整,或者你的目的蛋白本身就包涵体表达!
5楼2013-01-06 08:48:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
给我们电泳图片,显示你上柱前后的样品,流出液样品的差异!一般如果你的表达成功的话,会有明显的蛋白带。
shine
6楼2013-01-06 09:06:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该先检测目的蛋白表达后再上镍柱纯化,大肠杆菌会有表达可以与镍柱非特异性结合的蛋白的。
生活是一面镜子,要笑着面对!
7楼2013-01-06 10:34:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Chengxm

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
要确定有你要的蛋白表达出来才行, 才能看到底有没有分到东西。前后蛋白走电泳。
8楼2013-01-06 23:03:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xl0071334

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
同意9楼的观点,我知道的大肠杆菌中有个甲酸脱氢酶,会和Ni结合的
10楼2013-01-07 13:52:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 viki_MDK 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 301求调剂 +7 细胞相关蛋白 2026-04-03 7/350 2026-04-06 11:47 by lijunpoly
[考研] 求调剂,一志愿厦门大学,生物与医药,总分272,本科211 +4 Electron1cc 2026-04-01 5/250 2026-04-06 10:45 by barlinike
[考研] 生物与医药求调剂 +5 heguanhua 2026-04-05 6/300 2026-04-05 22:58 by Hdyxbekcb
[考研] 308求调剂 +3 终不似从前 2026-04-05 3/150 2026-04-05 22:23 by hemengdong
[考研] 材料调剂 +6 一样YWY 2026-04-05 6/300 2026-04-05 20:30 by 南航~万老师
[考研] 22408 总分320,一篇论文二作,两个国三,求调剂 +3 Leomulufu 2026-04-04 5/250 2026-04-05 19:04 by chongya
[考研] 08专硕275调剂 +5 AaAa7420 2026-04-05 5/250 2026-04-05 18:01 by jkddd
[考研] 282求调剂 +7 aaa车辆 2026-04-02 11/550 2026-04-05 17:24 by yulian1987
[考研] 调剂 +3 好好读书。 2026-04-02 3/150 2026-04-05 13:02 by arrow8852
[考研] 297求调剂 +11 ljy20040718! 2026-04-03 13/650 2026-04-04 09:23 by 来看流星雨10
[考研] 总分328生物与医药考数学求调剂 +7 aaadim 2026-04-02 9/450 2026-04-03 22:53 by syh9288
[考研] 考研调剂 +3 15615482637 2026-04-03 3/150 2026-04-03 22:50 by ms629
[考研] 085801 总分275 本科新能源 求调剂 +19 bradoner 2026-04-01 23/1150 2026-04-03 10:07 by linyelide
[考研] 求调剂!生物与医药专硕 +4 逆转陆先生 2026-04-01 5/250 2026-04-03 08:33 by Jaylen.
[考研] 298求B区调剂 +4 zzz,,r 2026-04-02 5/250 2026-04-02 12:17 by 土木硕士招生
[考研] 化学工程专硕324分,一志愿中国矿业大学求调剂 +7 耿耿1314 2026-04-01 7/350 2026-04-02 07:40 by 尚水阁主
[考研] 267求调剂 +13 uiybh 2026-03-31 13/650 2026-04-01 10:25 by 探123
[考研] 考研材料工程351分调剂 +5 整个好的 2026-03-31 5/250 2026-04-01 09:36 by topgun2009
[考研] 求调剂 生物学 377分 +6 zzll03 2026-03-31 6/300 2026-03-31 17:33 by 唐沐儿
[考研] 生物考研337分求调剂 +4 cgxin 2026-03-30 6/300 2026-03-31 14:18 by 记事本2026
信息提示
请填处理意见