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viki_MDK

银虫 (正式写手)

[求助] 关于镍柱纯化,急求,!!

真是太怪异了。
我用大肠杆菌表达了一个可溶性蛋白,经质粒测序,序列都是没问题的,,这个可溶性蛋白我用镍柱纯化,,细菌破碎后,,上清液我过镍柱,,经过淋洗后用高浓度咪唑洗脱,洗脱下来后浓缩,,然后SDS-PAGE检测,,发现 没有我的目的蛋白,而是大肠杆菌自身蛋白,,这是怎么回事?
这个情况我碰到两次了,,上次一个蛋白也是这种情况,,用镍柱纯化的蛋白不是我的目的蛋白,,,真是怪异,,急求!!!
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:57:55
amisking: 回帖置顶 2013-01-07 20:43:20
大肠杆菌的本底表达有些也是会与Ni-column结合的,这个正常。
我觉得主要还是要先确定是否有目的蛋白表达,然后再来考虑后续的纯化,
质粒转化至宿主菌后,目的蛋白能否表达受到很多因素的影响,不是序列正确了就一定有表达。
小兵一个
9楼2013-01-07 08:59:22
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

大家有碰到过这种情况吗
2楼2013-01-05 22:06:09
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
没纯化的总蛋白是否有目的蛋白呢?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-01-05 23:57:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:57:37
把诱导前的样品和诱导后的样品对比,确定诱导出的蛋白分子量正确。再把诱导的样品做全蛋白和可溶蛋白比较,确定蛋白是否真的在可溶部分。纯化时每个组(上柱前,flow through,wash,elute)分预留样品,做Western分析,确定纯化步骤中没有把目的蛋白丢失。
4楼2013-01-06 02:02:56
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