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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于镍柱纯化，急求，！！
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

[求助] 关于镍柱纯化，急求，！！

真是太怪异了。
我用大肠杆菌表达了一个可溶性蛋白，经质粒测序，序列都是没问题的，，这个可溶性蛋白我用镍柱纯化，，细菌破碎后，，上清液我过镍柱，，经过淋洗后用高浓度咪唑洗脱，洗脱下来后浓缩，，然后SDS-PAGE检测，，发现 没有我的目的蛋白，而是大肠杆菌自身蛋白，，这是怎么回事？
这个情况我碰到两次了，，上次一个蛋白也是这种情况，，用镍柱纯化的蛋白不是我的目的蛋白，，，真是怪异，，急求！！！
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1楼 2013-01-05 21:35:16
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
大家有碰到过这种情况吗
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2楼2013-01-05 22:06:09
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没纯化的总蛋白是否有目的蛋白呢？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-01-05 23:57:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:57:37
把诱导前的样品和诱导后的样品对比，确定诱导出的蛋白分子量正确。再把诱导的样品做全蛋白和可溶蛋白比较，确定蛋白是否真的在可溶部分。纯化时每个组（上柱前，flow through，wash，elute）分预留样品，做Western分析，确定纯化步骤中没有把目的蛋白丢失。
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4楼2013-01-06 02:02:56
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:57:45
前面的那位说的不错！
你这个目的是不是真的有表达，你也没有验证！序列正确是一方面，你还是要看诱导表达之后，sds-page检测一下是否有你的目的蛋白表达！
其二，很可能你的破菌上清中就没有目的蛋白！目的蛋白在你的破菌沉淀中！可能原因有可能是选择的buffer pH不合适，或者破菌条件需要调整，或者你的目的蛋白本身就包涵体表达！
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5楼2013-01-06 08:48:42
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
给我们电泳图片，显示你上柱前后的样品，流出液样品的差异！一般如果你的表达成功的话，会有明显的蛋白带。
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shine
6楼2013-01-06 09:06:09
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该先检测目的蛋白表达后再上镍柱纯化，大肠杆菌会有表达可以与镍柱非特异性结合的蛋白的。
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生活是一面镜子，要笑着面对！
7楼2013-01-06 10:34:19
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Chengxm

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要确定有你要的蛋白表达出来才行， 才能看到底有没有分到东西。前后蛋白走电泳。
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8楼2013-01-06 23:03:39
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:57:55
amisking: 回帖置顶 2013-01-07 20:43:20
大肠杆菌的本底表达有些也是会与Ni-column结合的，这个正常。
我觉得主要还是要先确定是否有目的蛋白表达，然后再来考虑后续的纯化，
质粒转化至宿主菌后，目的蛋白能否表达受到很多因素的影响，不是序列正确了就一定有表达。
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小兵一个
9楼2013-01-07 08:59:22
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xl0071334

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意9楼的观点，我知道的大肠杆菌中有个甲酸脱氢酶，会和Ni结合的
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10楼2013-01-07 13:52:33
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