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dy_414

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】镍柱纯化,洗不下来啊。。。已有5人参与

本人纯化一株定点突变蛋白,在原有蛋白的His tag末尾加上一个半胱氨酸,经过变性镍柱纯化咪唑洗脱,>80%的蛋白都没有洗下来,其他的蛋白,包括突变前的都可以洗脱的非常好~请问诸位大侠有没有类似的经历或者解决办法啊~~
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我坚信,rp是攒出来的
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flllgend

金虫 (正式写手)

衷心祝福楼主,我为金币而来
2楼2010-10-04 21:00:31
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)


reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-10-06 08:34:09
dy_414(金币+1): 2010-10-06 11:12:11
引用回帖:
Originally posted by dy_414 at 2010-10-04 20:58:14:
本人纯化一株定点突变蛋白,在原有蛋白的His tag末尾加上一个半胱氨酸,经过变性镍柱纯化咪唑洗脱,>80%的蛋白都没有洗下来,其他的蛋白,包括突变前的都可以洗脱的非常好~请问诸位大侠有没有类似的经历或者解 ...

你的imidozale 的浓度如何?增加看看
3楼2010-10-05 09:11:12
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kxxin66

金虫 (小有名气)

什么是“变性镍柱”?是指的包含体的变复性吗?如果是的话,可能沉淀在柱子上了或者就没挂柱子直接穿出了。
4楼2010-10-05 09:31:09
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lliu

新虫 (小有名气)


reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-10-06 08:34:17
用0.1-0.2M EDTA, 什么样的蛋白都能洗下来。之后用0.1M NiSO4 重新再生。
5楼2010-10-05 10:20:36
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dy_414

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-10-05 09:11:12:


你的imidozale 的浓度如何?增加看看

其他的那些蛋白用300mM都可以的,这个已经加到500mM了,可是还是不行啊。。。
我坚信,rp是攒出来的
6楼2010-10-05 11:31:53
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dy_414

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by kxxin66 at 2010-10-05 09:31:09:
什么是“变性镍柱”?是指的包含体的变复性吗?如果是的话,可能沉淀在柱子上了或者就没挂柱子直接穿出了。

是包涵体。
之前就是先用尿素溶解了,然后柱子也是尿素平衡的。
而且据柱前和流穿看,>90%的蛋白挂住了。。。
我坚信,rp是攒出来的
7楼2010-10-05 11:33:20
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dy_414

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lliu at 2010-10-05 10:20:36:
用0.1-0.2M EDTA, 什么样的蛋白都能洗下来。之后用0.1M NiSO4 重新再生。

这个恐怕不行吧,镍还和蛋白结合着呢。。。
我坚信,rp是攒出来的
8楼2010-10-05 11:33:46
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)


reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-10-06 08:34:44
引用回帖:
Originally posted by dy_414 at 2010-10-05 11:31:53:




其他的那些蛋白用300mM都可以的,这个已经加到500mM了,可是还是不行啊。。。

我的感觉和上面的一样,有可能使沉淀了。要不不至于在500mM下洗不下来
LZ换一种buffer试试
9楼2010-10-06 08:18:18
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lliu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by dy_414 at 2010-10-05 11:33:46:


这个恐怕不行吧,镍还和蛋白结合着呢。。。

建议你多看一些Protocols, 不要想当然就认为不行。
10楼2010-10-06 08:49:57
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