24小时热门版块排行榜    

查看: 3065  |  回复: 25

dy_414

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】镍柱纯化,洗不下来啊。。。 已有5人参与

本人纯化一株定点突变蛋白,在原有蛋白的His tag末尾加上一个半胱氨酸,经过变性镍柱纯化咪唑洗脱,>80%的蛋白都没有洗下来,其他的蛋白,包括突变前的都可以洗脱的非常好~请问诸位大侠有没有类似的经历或者解决办法啊~~
回复此楼
我坚信,rp是攒出来的
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flllgend

金虫 (正式写手)

衷心祝福楼主,我为金币而来
2楼2010-10-04 21:00:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)


reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-10-06 08:34:09
dy_414(金币+1): 2010-10-06 11:12:11
引用回帖:
Originally posted by dy_414 at 2010-10-04 20:58:14:
本人纯化一株定点突变蛋白,在原有蛋白的His tag末尾加上一个半胱氨酸,经过变性镍柱纯化咪唑洗脱,>80%的蛋白都没有洗下来,其他的蛋白,包括突变前的都可以洗脱的非常好~请问诸位大侠有没有类似的经历或者解 ...

你的imidozale 的浓度如何?增加看看
3楼2010-10-05 09:11:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kxxin66

金虫 (小有名气)

什么是“变性镍柱”?是指的包含体的变复性吗?如果是的话,可能沉淀在柱子上了或者就没挂柱子直接穿出了。
4楼2010-10-05 09:31:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lliu

新虫 (小有名气)


reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-10-06 08:34:17
用0.1-0.2M EDTA, 什么样的蛋白都能洗下来。之后用0.1M NiSO4 重新再生。
5楼2010-10-05 10:20:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dy_414

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-10-05 09:11:12:


你的imidozale 的浓度如何?增加看看

其他的那些蛋白用300mM都可以的,这个已经加到500mM了,可是还是不行啊。。。
我坚信,rp是攒出来的
6楼2010-10-05 11:31:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dy_414

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by kxxin66 at 2010-10-05 09:31:09:
什么是“变性镍柱”?是指的包含体的变复性吗?如果是的话,可能沉淀在柱子上了或者就没挂柱子直接穿出了。

是包涵体。
之前就是先用尿素溶解了,然后柱子也是尿素平衡的。
而且据柱前和流穿看,>90%的蛋白挂住了。。。
我坚信,rp是攒出来的
7楼2010-10-05 11:33:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dy_414

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by lliu at 2010-10-05 10:20:36:
用0.1-0.2M EDTA, 什么样的蛋白都能洗下来。之后用0.1M NiSO4 重新再生。

这个恐怕不行吧,镍还和蛋白结合着呢。。。
我坚信,rp是攒出来的
8楼2010-10-05 11:33:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)


reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-10-06 08:34:44
引用回帖:
Originally posted by dy_414 at 2010-10-05 11:31:53:




其他的那些蛋白用300mM都可以的,这个已经加到500mM了,可是还是不行啊。。。

我的感觉和上面的一样,有可能使沉淀了。要不不至于在500mM下洗不下来
LZ换一种buffer试试
9楼2010-10-06 08:18:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lliu

新虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by dy_414 at 2010-10-05 11:33:46:


这个恐怕不行吧,镍还和蛋白结合着呢。。。

建议你多看一些Protocols, 不要想当然就认为不行。
10楼2010-10-06 08:49:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 dy_414 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 言之凿凿,8月21号(明天)放榜 +13 医学老男孩 2026-08-20 15/750 2026-08-20 15:19 by chengyan1220
[基金申请] 时间戳又变了 +3 wuchongjun 2026-08-20 4/200 2026-08-20 15:18 by felixwseu
[基金申请] 时间戳变了,能看出什么问题? +17 基诺咪客 2026-08-17 21/1050 2026-08-20 14:54 by 昝占全2025
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +21 yaoyewhu2008 2026-08-20 21/1050 2026-08-20 10:37 by Vivilian
[基金申请] 今天基金会出结果吗?20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗? +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了,轻松一下,男人悄悄话,女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖? +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 明天放榜? +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液,抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
请填处理意见