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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 目的片段丢了一截
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路程

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段丢了一截

求指教，最近做TA克隆，目的基因和T载体连好后转化，挑单克隆提质粒，可是目的基因丢了好大一段，变小了，有虫友遇到相同问题吗，怎么解决的呢？
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1楼2012-12-27 17:10:29
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Lester11

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-28 17:25:43
这个问题我们实验室的一位师兄遇到过，挺麻烦的。
你看一看你的目的基因是不是有部分GC含量很高，这样的话PCR可能就跳过了那一部分，P出来的基因少一片断。
遇到这种情况你要换一种更有效的针对高GC的内切酶。
试试看吧，这种问题比较常见，多尝试，也是一个成长的过程。
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2楼2012-12-27 19:29:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看看丢掉的那一段是不是重复序列
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2012-12-27 20:53:13
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zyqdyk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 股鼓励交流 2012-12-28 17:25:56
目的基因少了一段是指菌落PCR结果还是测序结果？
如果菌落PCR结果有可能你用的T载体的通用引物与基因上的一段序列相同或类似，再有可能染菌。
如果是测序结果得到的只是一段我就不是很明白了，个人认为这种情况一般不会出现。
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4楼2012-12-28 11:17:14
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路程

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Lester11 at 2012-12-27 19:29:22
这个问题我们实验室的一位师兄遇到过，挺麻烦的。
你看一看你的目的基因是不是有部分GC含量很高，这样的话PCR可能就跳过了那一部分，P出来的基因少一片断。
遇到这种情况你要换一种更有效的针对高GC的内切酶。
试 ...

感谢回复，目的片段TA克隆之前跑电泳条带正常，转化完提出质粒就少了一大截，应该不是pcr的问题
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5楼2012-12-28 14:49:53
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路程

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-27 20:53:13
看看丢掉的那一段是不是重复序列

感谢回复，目测不是重复序列，丢得太多，800多个bp，请问如果是因为重复序列而引起丢失，这种情况是必然的还是偶然的呢？与宿主有关系吗？
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6楼2012-12-28 14:52:32
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路程

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zyqdyk at 2012-12-28 11:17:14
目的基因少了一段是指菌落PCR结果还是测序结果？
如果菌落PCR结果有可能你用的T载体的通用引物与基因上的一段序列相同或类似，再有可能染菌。
如果是测序结果得到的只是一段我就不是很明白了，个人认为这种情况一 ...

是测序结果
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7楼2012-12-28 14:53:03
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 质粒是超螺旋，不切开电泳看不出确切的分子量，和Marker比是没有意义的
2.  建议测序后再说少没少，如果的确少了，最有可能的情况是一条引物的末端有重复序列，测序后自然就知道了，解决方法是把引物加长，用高退火重新扩。
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生命不息，探索不止。
8楼2012-12-30 12:18:10
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不好意思，没看到别人的回帖，测序了就是第二种情况了，引物末端有重叠，4个碱基就能扩出来，我遇到过这种情况，把引物加长五六bp就行了。
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生命不息，探索不止。
9楼2012-12-30 12:21:40
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路程

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Arrennew at 2012-12-30 12:21:40
不好意思，没看到别人的回帖，测序了就是第二种情况了，引物末端有重叠，4个碱基就能扩出来，我遇到过这种情况，把引物加长五六bp就行了。

谢谢回复，4个碱基就能扩出来是什么意思？
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10楼2012-12-30 12:50:05
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