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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求大师指导下~最近一个月都在重复插目的片段可是结果很奇怪啊~
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lecou

新虫 (初入文坛)

[求助] 求大师指导下~最近一个月都在重复插目的片段可是结果很奇怪啊~

我用的是穿梭质粒ycp50，8k左右，用的bamH1 和hind3双酶切，将一个目的片段大约6k的插进去，可是已经做了一个月了，开始做双酶切和单酶切进行验证，但是都没有出现十几k的目的质粒，前几天设计了引物，pcr目的片段中的一段，约800bp，出现了目的条带，可是酶切确实阴性结果，这是怎么了？说的有点多，不知道能不能理解，希望高手指点下，不懂得细节再交流~
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希望自己能平常心面对实验中的种种
1楼 2012-08-24 18:11:44
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lecou

新虫 (初入文坛)
顶一下，怎么没人回啊，大家帮帮忙嘿嘿
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希望自己能平常心面对实验中的种种
2楼2012-08-29 14:31:29
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三十不惑

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的PCR使用阴性对照了吗？你先排除一下PCR反应的假阳性吧
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lecou
个性签名
3楼2012-08-29 20:08:01
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 辛苦了 2012-08-30 14:36:22
单酶切14K你能看到？一般用marker最大只有10K。
双酶切试试吧
不过片段比较大，体系选择恰当些，不行就该酶切体系。只能酶切验证了！
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lecou
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2012-08-29 21:07:38
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-30 14:36:31
你的片段是有点大，你确定下你双酶是否在目的片段中也有酶切位点？或者换下酶切体系，酶切过夜。。。。。。祝实验顺利！！！
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lecou
5楼2012-08-30 09:31:21
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lecou

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 三十不惑 at 2012-08-29 20:08:01
你的PCR使用阴性对照了吗？你先排除一下PCR反应的假阳性吧

阴性对照阳性对照都有，结果也都正常，做了好几遍的pcr验证都一样~
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希望自己能平常心面对实验中的种种
6楼2012-08-31 14:12:13
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lecou

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2012-08-29 21:07:38
单酶切14K你能看到？一般用marker最大只有10K。
双酶切试试吧
不过片段比较大，体系选择恰当些，不行就该酶切体系。只能酶切验证了！

我们实验室有15k的maker，就是要跑久一点才能分开的清楚。一直在尝试各种酶切体系，不过转化只酶切空对照看酶切的都挺完全的，谢啦~
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希望自己能平常心面对实验中的种种
7楼2012-08-31 14:15:38
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lecou

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-08-30 09:31:21
你的片段是有点大，你确定下你双酶是否在目的片段中也有酶切位点？或者换下酶切体系，酶切过夜。。。。。。祝实验顺利！！！

我也确认过酶切位点没问题，尝试下酶切久一点~谢谢
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希望自己能平常心面对实验中的种种
8楼2012-08-31 14:17:36
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