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lvye3707

金虫 (正式写手)

[求助] 重组质粒酶切

我的目的片段是1600左右,酶切位点是Xba I和Sac I ,载体时pMD18-T simple vector,第一张是重组质粒(marker后的4个泳带),第二张是重组质粒酶切后的(marker后的4个泳带),酶切后怎么会出现三条带?是我没酶切彻底嘛?

2012.12.11 提质粒 T正 与 PBI121.jpg



2012.12.12 酶切.jpg
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

引用回帖:
7楼: Originally posted by lvye3707 at 2012-12-12 17:00:56
我用的是 试剂盒提的,100ml  LB+100ul重组质粒+100ul 氨苄,摇到菌液发白,我查了说可能是RNA,在提取过程中,我还特意放置了一段时间,请问能怎么除去呢?对后续试验有什么影响?...

可以直接向质粒里面加1-2 uL的Rnase处理1-2 h。

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Thank-you,so-blue.
8楼2012-12-12 17:31:20
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普通回帖

laihx38j

禁虫 (职业作家)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2012-12-12 15:58:13
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lvye3707

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by laihx38j at 2012-12-12 15:58:13
根据你的电泳图显示,你这是典型的酶切不彻底。建议加大酶量或减少质粒的量

说明书说质粒DNA不大于1ug,我估算,质粒的量还不够。说酶切不彻底是因为没有目的条带么?
3楼2012-12-12 16:03:40
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laihx38j

禁虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
lvye3707: 金币+10 2012-12-12 17:01:20
lvye3707: 回帖置顶 2012-12-12 19:53:08
本帖内容被屏蔽

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

4楼2012-12-12 16:35:12
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

跑到最前面的是啥东西,没有除RNA吧。
Thank-you,so-blue.
5楼2012-12-12 16:36:51
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lvye3707

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by laihx38j at 2012-12-12 16:35:12
判断酶切不彻底,是因为酶切后还可见没有切开的条带(你把酶切前和酶切后的样品点到同一块胶就可以看见了)

另外没有目的条带,可能是因为只有一个酶发挥了作用,仔细检查一下试剂和酶切体系、条件。

如果没 ...

我酶切后为什么成了3条带呢?
6楼2012-12-12 16:58:31
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lvye3707

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by susizheng at 2012-12-12 16:36:51
跑到最前面的是啥东西,没有除RNA吧。

我用的是 试剂盒提的,100ml  LB+100ul重组质粒+100ul 氨苄,摇到菌液发白,我查了说可能是RNA,在提取过程中,我还特意放置了一段时间,请问能怎么除去呢?对后续试验有什么影响?
7楼2012-12-12 17:00:56
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lvye3707

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by susizheng at 2012-12-12 17:31:20
可以直接向质粒里面加1-2 uL的Rnase处理1-2 h。...

谢谢了
9楼2012-12-12 18:14:17
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-12-13 09:32:23
最前面的RNA干扰了你的目的条带,除RNA后彻底酶切
一直向前!
10楼2012-12-13 08:59:09
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