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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关基因组提取问题
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 有关基因组提取问题

我现在用自己配制的试剂提基因组来构建基因文库。提取的大致流程是：
1、用20mg/ml的溶菌酶37℃处理一小时。
2.、再用蛋白酶K处理半小时。
3、然后加异丙醇析出基因组，一般在这一步就会出现丝状物，再用枪头挑出。
4、晾干，用TE溶解，再用酚氯仿抽提两次。
5、用冷的无水乙醇沉淀。
6/70%的乙醇洗一次
8、TE保存。
问题是，在用异丙醇析出的这一步，并没有丝状物出现，而是溶液变浑浊而已，所以就没有用枪头挑，直接离心取沉淀，但越往后做，根本没有沉淀，在用冷的无水乙醇沉淀这一步根本没有沉淀出现，已经提了三次了，都是这个显现，请问哪位大侠能帮忙分析一下是哪里出问题了？谢谢~~~
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nothing isimpossible
1楼 2012-11-11 19:46:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-14 16:26:51
你做的是什么菌？可能是对溶菌酶不敏感，看适当增加溶菌酶处理时间。此外，溶菌酶处理后最好加入含有一定量的SDS裂解液使细胞破碎更完全。破碎后的菌液比破碎前要透明，溶液变粘稠。
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2楼2012-11-12 02:38:37
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们提基因组的时候通常在加入蛋白酶处理半小时后，加入终浓度为1-2%的SDS再处理1小时。
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3楼2012-11-12 09:36:42
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hippo_li at 2012-11-12 09:36:42
我们提基因组的时候通常在加入蛋白酶处理半小时后，加入终浓度为1-2%的SDS再处理1小时。

你们的体系大概是多大，用多少菌体提的？
我是这样做的：离心1.5ml的菌体，180ul溶菌酶（20mg/ml)处理40——60min（37℃），再用蛋白酶K处理30min（65℃）。后面就是用异丙醇沉淀，酚氯仿抽提两次，无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗涤。
还有，溶菌酶处理后没有粘稠状，只是管底有许多细胞碎片。能帮我分析一下原因吗？
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nothing isimpossible
4楼2012-11-12 13:25:24
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-12 02:38:37
你做的是什么菌？可能是对溶菌酶不敏感，看适当增加溶菌酶处理时间。此外，溶菌酶处理后最好加入含有一定量的SDS裂解液使细胞破碎更完全。破碎后的菌液比破碎前要透明，溶液变粘稠。

你们是很明显就能看到DNA沉淀吗？
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nothing isimpossible
5楼2012-11-12 13:26:05
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-12 02:38:37
你做的是什么菌？可能是对溶菌酶不敏感，看适当增加溶菌酶处理时间。此外，溶菌酶处理后最好加入含有一定量的SDS裂解液使细胞破碎更完全。破碎后的菌液比破碎前要透明，溶液变粘稠。

这个菌我上学期也做过，提出来了，只是跑电泳发现有些降解，所以想再提一次。我是用溶菌酶，蛋白酶K处理后，用异丙醇析出DNA，再用酚，氯仿抽提。可是最近连着做了三次，都没有做出来。三次的现象是这样的：
第一次：取4ml菌，在蛋白酶K处理后，离心，取上清，可是沉淀是很粘稠的一坨，吸不上来；最后在加入异丙醇后，没有丝状物出现（上次是有丝状物出现）。怀疑菌量太多。
第二次“取1.5ml菌，蛋白酶K处理后，溶液离心，一点都不粘稠，很容易就把上清分离出来，但是加入异丙醇后还是没有丝状物出现，只是变浑浊了，直到最后一步，也没有沉淀出现。
我一直怀疑是在溶菌酶处理，蛋白酶K处理时有问题，但都是按之前的步骤来的，怎么也提不出来。
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nothing isimpossible
6楼2012-11-12 13:27:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hraikeyan: 金币+3 2012-11-14 09:22:30
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-14 16:27:06
引用回帖:
6楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-11-12 13:27:58
这个菌我上学期也做过，提出来了，只是跑电泳发现有些降解，所以想再提一次。我是用溶菌酶，蛋白酶K处理后，用异丙醇析出DNA，再用酚，氯仿抽提。可是最近连着做了三次，都没有做出来。三次的现象是这样的：
第一 ...

菌量的确影响裂解效果和溶液的粘稠度的。如果太多的话提出的DNA也杂质多。你有没有测一下收的菌的OD？一般异丙醇沉淀是时候可以看到丝状沉淀，如果没有可能是DNA太少了。如果你觉得直接用异丙醇沉淀太粘，可能是蛋白太多，可以先用酚氯仿抽一下再沉淀。
DNA是比较稳定的，如果不加DNase是很难降解的。可能是操作不够温柔造成断裂吧。话说回来，不管怎样做，提出的DNA也不可能是全长的，只是断裂的程度不同。
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7楼2012-11-13 08:07:13
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448935271

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实在不行，你就老老实实的用买来的试剂盒吧
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万物皆有毒，只要剂量足
8楼2012-11-13 08:58:46
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
hraikeyan: 金币+3 2012-11-14 09:26:56
引用回帖:
4楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-11-12 13:25:24
你们的体系大概是多大，用多少菌体提的？
我是这样做的：离心1.5ml的菌体，180ul溶菌酶（20mg/ml)处理40——60min（37℃），再用蛋白酶K处理30min（65℃）。后面就是用异丙醇沉淀，酚氯仿抽提两次，无水乙醇沉淀， ...

不知道你做的是什么菌，是革兰氏阳性菌吗？我提的是放线菌，如果是提基因组来建库，通常是大体积的提，50 mL培养液的菌体，如果只是检测用，体积就很小，提取方法也有不同。
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9楼2012-11-13 16:44:25
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hippo_li at 2012-11-13 16:44:25
不知道你做的是什么菌，是革兰氏阳性菌吗？我提的是放线菌，如果是提基因组来建库，通常是大体积的提，50 mL培养液的菌体，如果只是检测用，体积就很小，提取方法也有不同。...

我的是革兰氏阳性菌，我是构建基因文库，你们也构建基因文库吗？能把你们的提取方式给我吗？我的片段是2-6kb，能用试剂盒提吗？
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nothing isimpossible
10楼2012-11-14 09:26:46
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