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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 提取细菌基因组DNA时出现问题，求帮助
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zcz772170623

铜虫 (小有名气)

[求助] 提取细菌基因组DNA时出现问题，求帮助 已有1人参与

这是我的提取方法
1、收集培养好的细菌菌体2mL。12000rpm，1min，弃上清液。
2、加入200uL溶液I，涡旋振荡混匀。
3、加入200uL 2X的细菌裂解液，颠倒混匀，室温反应30min，中间反复颠倒混匀数次。
4、加入200uL 5M的氯化钠混匀，颠倒混匀，12000rpm，15~20min，取上清。
5、加入1/5体积的CTAB/NaCl，颠倒混匀，混匀65℃（金属浴），30min。
6、12000rpm，15~20min，取上清。
7、向上清液中加入0.5mL浓度为10mg/mL的RnaseA，37℃，30min。（可不做）
8、加入等体积的酚/氯仿（1:1）（异戊醇是为了消沫，可不用），12000rpm，15min。取上清液重复至无中间层。
9、加入等体积的氯仿，12000rpm，15min。
10、取上清液加入0.6倍体积冰预冷的异丙醇沉淀过夜（-20℃），4℃，12000rpm，15min。
11、冰预冷的70%乙醇洗两次，无水乙醇洗一次。
12、干燥后用适量TE溶解。

溶液I：等同于提取质粒所用的溶液I
50mM 葡萄糖、25mM Tris-Cl（pH8.0）、10mM EDTA（pH8.0）、高压灭菌

1X裂解液：
40mM Tris-醋酸，20mM 醋酸钠（pH7.8），1mMEDTA，1%SDS
配制100mL裂解液：1M Tris-醋酸4mL，0.5M EDTA 200uL，3M 醋酸钠（pH7.8） 667uL，SDS 1g
配制2X的将各试剂加大一倍。

CTAB/NaCl：
5% CTAB；1.4M NaCl；50mM Tris-cL

在到了第2步的时候，出现的白色沉淀怎么都离心不下来，飘在上清液里，吸了些上清液之后，在第3步离心的时候就根本没有上清液了，是白色的果冻一样，不知道是怎么回事。
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1楼 2014-07-09 09:35:19
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奋斗老青年

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-09 13:15:39
zcz772170623: 金币+10, ★有帮助 2014-07-09 17:23:19
看lz上面说的好像是用试剂盒提的，试剂盒首先要看看过期没，如果没有是不是和别人共用的时候有液体不小心污染了还是次序搞错了啦啊！！
可以问问客服技术服务部的！！
再做一遍试试！！
赞一下 回复此楼
想考关于植物病理专业、植物检疫专业方面的博士，请前辈们给点帮助和建议，
2楼2014-07-09 11:51:14
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zcz772170623

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 奋斗老青年 at 2014-07-09 11:51:14
看lz上面说的好像是用试剂盒提的，试剂盒首先要看看过期没，如果没有是不是和别人共用的时候有液体不小心污染了还是次序搞错了啦啊！！
可以问问客服技术服务部的！！
再做一遍试试！！

不是试剂盒，试剂重配了也没用
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3楼2014-07-09 14:40:31
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匿名

用户注销 (小有名气)

小辉辉
本帖仅楼主可见
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4楼2014-07-09 17:13:39
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奋斗老青年

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zcz772170623 at 2014-07-09 14:40:31
不是试剂盒，试剂重配了也没用...

那你的好好找问题了啊！！
要从头看实验用的方法啊！
还有提取试剂的配置啊！！
放提取液的瓶子干部干净，灭菌了没啊！？
等等很多！！
估计你要从头到尾的仔细再来一遍啊！！！！
努力吧！！
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想考关于植物病理专业、植物检疫专业方面的博士，请前辈们给点帮助和建议，
5楼2014-07-09 17:26:57
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laojiu9878

至尊木虫 (文坛精英)

九牛
反复抽提，加大离心力
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但愿人长久
6楼2014-07-10 10:38:11
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