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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 提取细菌基因组DNA时出现问题，求帮助
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zcz772170623

铜虫 (小有名气)

[求助] 提取细菌基因组DNA时出现问题，求帮助 已有1人参与

这是我的提取方法
1、收集培养好的细菌菌体2mL。12000rpm，1min，弃上清液。
2、加入200uL溶液I，涡旋振荡混匀。
3、加入200uL 2X的细菌裂解液，颠倒混匀，室温反应30min，中间反复颠倒混匀数次。
4、加入200uL 5M的氯化钠混匀，颠倒混匀，12000rpm，15~20min，取上清。
5、加入1/5体积的CTAB/NaCl，颠倒混匀，混匀65℃（金属浴），30min。
6、12000rpm，15~20min，取上清。
7、向上清液中加入0.5mL浓度为10mg/mL的RnaseA，37℃，30min。（可不做）
8、加入等体积的酚/氯仿（1:1）（异戊醇是为了消沫，可不用），12000rpm，15min。取上清液重复至无中间层。
9、加入等体积的氯仿，12000rpm，15min。
10、取上清液加入0.6倍体积冰预冷的异丙醇沉淀过夜（-20℃），4℃，12000rpm，15min。
11、冰预冷的70%乙醇洗两次，无水乙醇洗一次。
12、干燥后用适量TE溶解。

溶液I：等同于提取质粒所用的溶液I
50mM 葡萄糖、25mM Tris-Cl（pH8.0）、10mM EDTA（pH8.0）、高压灭菌

1X裂解液：
40mM Tris-醋酸，20mM 醋酸钠（pH7.8），1mMEDTA，1%SDS
配制100mL裂解液：1M Tris-醋酸4mL，0.5M EDTA 200uL，3M 醋酸钠（pH7.8） 667uL，SDS 1g
配制2X的将各试剂加大一倍。

CTAB/NaCl：
5% CTAB；1.4M NaCl；50mM Tris-cL

在到了第2步的时候，出现的白色沉淀怎么都离心不下来，飘在上清液里，吸了些上清液之后，在第3步离心的时候就根本没有上清液了，是白色的果冻一样，不知道是怎么回事。
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1楼 2014-07-09 09:35:19
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laojiu9878

至尊木虫 (知名作家)

九牛
反复抽提，加大离心力
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但愿人长久
6楼2014-07-10 10:38:11
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