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mqs123

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hraikeyan: 金币+2 2012-11-20 12:02:17
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-11-20 17:15:19
我的也是革兰氏阳性菌建库,提取的基因组质量还可以,提取的步骤和你的不同,蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时,时间太短,消化的不是很好,然后加入10%SDS,用酚氯仿和氯仿抽提,在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离心,加入40ul溶菌酶,加多了反而不好,你可以根据反应情况看看,再决定是否添加点。链霉菌的孢子比较难破壁,收集的菌体也比较少。
11楼2012-11-19 21:37:47
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-19 21:37:47
我的也是革兰氏阳性菌建库,提取的基因组质量还可以,提取的步骤和你的不同,蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时,时间太短,消化的不是很好,然后加入10%SDS,用酚氯仿和氯仿抽提,在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离 ...

你的10%的SDS是在蛋白酶K处理1h后,再加的吗?还是和蛋白酶K一起加入?
nothing isimpossible
12楼2012-11-20 12:02:10
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-19 21:37:47
我的也是革兰氏阳性菌建库,提取的基因组质量还可以,提取的步骤和你的不同,蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时,时间太短,消化的不是很好,然后加入10%SDS,用酚氯仿和氯仿抽提,在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离 ...

能把你们的具体步骤传给我吗?
nothing isimpossible
13楼2012-11-20 19:40:21
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-19 21:37:47
我的也是革兰氏阳性菌建库,提取的基因组质量还可以,提取的步骤和你的不同,蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时,时间太短,消化的不是很好,然后加入10%SDS,用酚氯仿和氯仿抽提,在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离 ...

能把你的具体步骤传上来吗?我用我的方法一直提不出来,想参考一下你的。
nothing isimpossible
14楼2012-11-21 09:13:21
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mqs123

金虫 (初入文坛)

先加蛋白酶K,55度消化一段时间,在加入SDS,继续反映
15楼2012-11-22 13:53:17
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mqs123

金虫 (初入文坛)

用的盐析法,链霉菌提基因组的方法,链霉菌也是革兰氏阳性菌,在这个方法上调节了溶菌酶和蛋白酶K的量和时间,每个菌不同,加的量也有相应的区别
16楼2012-11-22 14:00:33
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mqs123

金虫 (初入文坛)

而且你的菌收集最好在对数生长期,不要长的时间太长,到后期会产生很多代谢产物,干扰基因组的提取。
17楼2012-11-22 14:05:20
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-22 14:00:33
用的盐析法,链霉菌提基因组的方法,链霉菌也是革兰氏阳性菌,在这个方法上调节了溶菌酶和蛋白酶K的量和时间,每个菌不同,加的量也有相应的区别

你是离心多少毫升的菌液,才够建基因组的?
nothing isimpossible
18楼2012-11-22 22:06:14
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mqs123

金虫 (初入文坛)

离心后剩大概收集100UL的菌体。
19楼2012-11-23 08:27:16
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野草99688

银虫 (小有名气)

我个人认为!是你加的异戊醇的体积有问题!本人以前也做过。2.5倍体积沉淀,这个量不能少!或者这步省掉,离心后用等体积氯仿异戊醇抽提,去除蛋白后,直接沉淀,你可以试试!
20楼2013-03-20 09:59:14
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