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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关基因组提取问题
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mqs123

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hraikeyan: 金币+2 2012-11-20 12:02:17
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-11-20 17:15:19
我的也是革兰氏阳性菌建库，提取的基因组质量还可以，提取的步骤和你的不同，蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时，时间太短，消化的不是很好，然后加入10%SDS，用酚氯仿和氯仿抽提，在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离心，加入40ul溶菌酶，加多了反而不好，你可以根据反应情况看看，再决定是否添加点。链霉菌的孢子比较难破壁，收集的菌体也比较少。
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11楼2012-11-19 21:37:47
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-19 21:37:47
我的也是革兰氏阳性菌建库，提取的基因组质量还可以，提取的步骤和你的不同，蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时，时间太短，消化的不是很好，然后加入10%SDS，用酚氯仿和氯仿抽提，在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离 ...

你的10%的SDS是在蛋白酶K处理1h后，再加的吗？还是和蛋白酶K一起加入？
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nothing isimpossible
12楼2012-11-20 12:02:10
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-19 21:37:47
我的也是革兰氏阳性菌建库，提取的基因组质量还可以，提取的步骤和你的不同，蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时，时间太短，消化的不是很好，然后加入10%SDS，用酚氯仿和氯仿抽提，在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离 ...

能把你们的具体步骤传给我吗？
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nothing isimpossible
13楼2012-11-20 19:40:21
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-19 21:37:47
我的也是革兰氏阳性菌建库，提取的基因组质量还可以，提取的步骤和你的不同，蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时，时间太短，消化的不是很好，然后加入10%SDS，用酚氯仿和氯仿抽提，在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离 ...

能把你的具体步骤传上来吗？我用我的方法一直提不出来，想参考一下你的。
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nothing isimpossible
14楼2012-11-21 09:13:21
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mqs123

金虫 (初入文坛)
先加蛋白酶K,55度消化一段时间，在加入SDS，继续反映
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15楼2012-11-22 13:53:17
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mqs123

金虫 (初入文坛)
用的盐析法，链霉菌提基因组的方法，链霉菌也是革兰氏阳性菌，在这个方法上调节了溶菌酶和蛋白酶K的量和时间，每个菌不同，加的量也有相应的区别
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16楼2012-11-22 14:00:33
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mqs123

金虫 (初入文坛)
而且你的菌收集最好在对数生长期，不要长的时间太长，到后期会产生很多代谢产物，干扰基因组的提取。
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17楼2012-11-22 14:05:20
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-22 14:00:33
用的盐析法，链霉菌提基因组的方法，链霉菌也是革兰氏阳性菌，在这个方法上调节了溶菌酶和蛋白酶K的量和时间，每个菌不同，加的量也有相应的区别

你是离心多少毫升的菌液，才够建基因组的？
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nothing isimpossible
18楼2012-11-22 22:06:14
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mqs123

金虫 (初入文坛)
离心后剩大概收集100UL的菌体。
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19楼2012-11-23 08:27:16
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野草99688

银虫 (小有名气)
我个人认为！是你加的异戊醇的体积有问题！本人以前也做过。2.5倍体积沉淀，这个量不能少！或者这步省掉，离心后用等体积氯仿异戊醇抽提，去除蛋白后，直接沉淀，你可以试试！
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20楼2013-03-20 09:59:14
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