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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关基因组提取问题
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 有关基因组提取问题

我现在用自己配制的试剂提基因组来构建基因文库。提取的大致流程是：
1、用20mg/ml的溶菌酶37℃处理一小时。
2.、再用蛋白酶K处理半小时。
3、然后加异丙醇析出基因组，一般在这一步就会出现丝状物，再用枪头挑出。
4、晾干，用TE溶解，再用酚氯仿抽提两次。
5、用冷的无水乙醇沉淀。
6/70%的乙醇洗一次
8、TE保存。
问题是，在用异丙醇析出的这一步，并没有丝状物出现，而是溶液变浑浊而已，所以就没有用枪头挑，直接离心取沉淀，但越往后做，根本没有沉淀，在用冷的无水乙醇沉淀这一步根本没有沉淀出现，已经提了三次了，都是这个显现，请问哪位大侠能帮忙分析一下是哪里出问题了？谢谢~~~
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nothing isimpossible
1楼 2012-11-11 19:46:05
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by mqs123 at 2012-11-19 21:37:47
我的也是革兰氏阳性菌建库，提取的基因组质量还可以，提取的步骤和你的不同，蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时，时间太短，消化的不是很好，然后加入10%SDS，用酚氯仿和氯仿抽提，在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离 ...

能把你的具体步骤传上来吗？我用我的方法一直提不出来，想参考一下你的。
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nothing isimpossible
14楼2012-11-21 09:13:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-14 16:26:51
你做的是什么菌？可能是对溶菌酶不敏感，看适当增加溶菌酶处理时间。此外，溶菌酶处理后最好加入含有一定量的SDS裂解液使细胞破碎更完全。破碎后的菌液比破碎前要透明，溶液变粘稠。
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2楼2012-11-12 02:38:37
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们提基因组的时候通常在加入蛋白酶处理半小时后，加入终浓度为1-2%的SDS再处理1小时。
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3楼2012-11-12 09:36:42
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hippo_li at 2012-11-12 09:36:42
我们提基因组的时候通常在加入蛋白酶处理半小时后，加入终浓度为1-2%的SDS再处理1小时。

你们的体系大概是多大，用多少菌体提的？
我是这样做的：离心1.5ml的菌体，180ul溶菌酶（20mg/ml)处理40——60min（37℃），再用蛋白酶K处理30min（65℃）。后面就是用异丙醇沉淀，酚氯仿抽提两次，无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗涤。
还有，溶菌酶处理后没有粘稠状，只是管底有许多细胞碎片。能帮我分析一下原因吗？
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nothing isimpossible
4楼2012-11-12 13:25:24
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