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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 有关基因组提取问题

我现在用自己配制的试剂提基因组来构建基因文库。提取的大致流程是:
1、用20mg/ml的溶菌酶37℃处理一小时。
2.、再用蛋白酶K处理半小时。
3、然后加异丙醇析出基因组,一般在这一步就会出现丝状物,再用枪头挑出。
4、晾干,用TE溶解,再用酚氯仿抽提两次。
5、用冷的无水乙醇沉淀。
6/70%的乙醇洗一次
8、TE保存。
问题是,在用异丙醇析出的这一步,并没有丝状物出现,而是溶液变浑浊而已,所以就没有用枪头挑,直接离心取沉淀,但越往后做,根本没有沉淀,在用冷的无水乙醇沉淀这一步根本没有沉淀出现,已经提了三次了,都是这个显现,请问哪位大侠能帮忙分析一下是哪里出问题了?谢谢~~~
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nothing isimpossible
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mqs123

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hraikeyan: 金币+2 2012-11-20 12:02:17
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-11-20 17:15:19
我的也是革兰氏阳性菌建库,提取的基因组质量还可以,提取的步骤和你的不同,蛋白酶K 一般55度作用时间是一个小时,时间太短,消化的不是很好,然后加入10%SDS,用酚氯仿和氯仿抽提,在加入异丙醇沉淀。5ml的菌液离心,加入40ul溶菌酶,加多了反而不好,你可以根据反应情况看看,再决定是否添加点。链霉菌的孢子比较难破壁,收集的菌体也比较少。
11楼2012-11-19 21:37:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-14 16:26:51
你做的是什么菌?可能是对溶菌酶不敏感,看适当增加溶菌酶处理时间。此外,溶菌酶处理后最好加入含有一定量的SDS裂解液使细胞破碎更完全。破碎后的菌液比破碎前要透明,溶液变粘稠。
2楼2012-11-12 02:38:37
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们提基因组的时候通常在加入蛋白酶处理半小时后,加入终浓度为1-2%的SDS再处理1小时。
3楼2012-11-12 09:36:42
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hippo_li at 2012-11-12 09:36:42
我们提基因组的时候通常在加入蛋白酶处理半小时后,加入终浓度为1-2%的SDS再处理1小时。

你们的体系大概是多大,用多少菌体提的?
我是这样做的:离心1.5ml的菌体,180ul溶菌酶(20mg/ml)处理40——60min(37℃),再用蛋白酶K处理30min(65℃)。后面就是用异丙醇沉淀,酚氯仿抽提两次,无水乙醇沉淀,70%的乙醇洗涤。
还有,溶菌酶处理后没有粘稠状,只是管底有许多细胞碎片。能帮我分析一下原因吗?
nothing isimpossible
4楼2012-11-12 13:25:24
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