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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 16S rDNA测序问题
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)

[求助] 16S rDNA测序问题已有2人参与

各位前辈，我想请教一下16S rDNA测序问题。我要鉴定一个未知菌，用试剂盒提基因组DNA，然后用通用引物PCR，在1500bp处有很亮的条带，又将PCR产物割胶纯化，然后送去测序，测了两次都没测通。测序公司给了我一下三个可能性。
1.已纯化的PCR样品造成这种情况的原因是由于模板纯化有一定问题，模板中含有非特异性的条带；
2.如果是未纯化的PCR产物，那么有可能是您要求测序的片段周围含有大小相近的条带，我们通过琼脂糖凝胶回收，无法有效切除这种大小差别不是很明显的条带；
3.模板或是引物质量较差，测序反应结束之后没有产生足够的目的产物，导致测序信号较弱，杂背景较高，形成重叠现象。
我看了一些文献，好多就是直接把PCR产物测序，我这个也有条带啊，怎么就测不出来呢？我怀疑是我的菌不够纯，都划线6次以上了。请各位前辈们看看我这问题出在哪里了？
还有，对于鉴定菌我一直迷茫是先做生理生化鉴定还是先做16S鉴定，做生理生化鉴定我不知道该做哪些指标。。。
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1楼2012-07-19 22:30:36
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

girlfisher

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-20 20:56:18
存在一种可能，你的细菌具有多个16S rDNA拷贝，这些拷贝间存在差异，因此测序出现杂峰。如果是这种情况则必须克隆测序。
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3楼2012-07-20 09:52:13
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tankleiming

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

听我的亲，花个3.4百块钱，直接让他们公司的鉴定到属，在根据属来做生化，很多情况下可以确定种了，一般一个礼拜就搞定了，他们说的什么pcr，连载体什么的完全是蛋疼啊，
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之所以深沉
15楼2012-07-24 21:28:43
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普通回帖

nancyyazi

铜虫 (小有名气)
额，额，米有人遇到过这样的问题啊？
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2楼2012-07-20 09:16:35
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baopeng

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by girlfisher at 2012-07-20 09:52:13
存在一种可能，你的细菌具有多个16S rDNA拷贝，这些拷贝间存在差异，因此测序出现杂峰。如果是这种情况则必须克隆测序。

可否详细讲解一下？
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4楼2012-07-20 12:23:15
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是挑的单菌提的DNA吗？
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5楼2012-07-20 15:41:38
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shicaozhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-20 20:56:34
16srDNA鉴定的话最好是连接到T载上面去测，PCR产物一般测不出来，做个蓝白斑很快的，两天就搞定了。
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6楼2012-07-20 19:16:53
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shicaozhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

16srDNA鉴定的话最好是连接到T载上面去测，PCR产物一般测不出来，做个蓝白斑很快的，两天就搞定了。
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7楼2012-07-20 19:17:28
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nancyyazi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by tingspdf at 2012-07-20 15:41:38
是挑的单菌提的DNA吗？

是从我纯化好的斜面上挑的菌
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8楼2012-07-20 20:58:53
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
注意避免扩增体系污染 做个NTC看看

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2012-07-21 00:02:13
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jipojiong

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意三楼，确实存在多个16S rDNA拷贝，相关的文献可以查找关于rpoB的文献。建议做克隆吧。顺利2天出结果。
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咦~飞碟！！
10楼2012-07-21 16:42:13
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