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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)

[交流] 求助，巢式PCR，出了点儿问题，！

第一步pcr都是25微升的体系，12.5微升的premix，上下游引物都是0.5微升，模版是2微升。。。
第二步50微升体系premix，上下游引物1微升，模版2微升
哪里出问题了，难道是我的操作？
师兄做的p出来的条带很亮很好，应该不是引物设计问题吧。
为什么我做的阳性对照有条带而且非常的弱，我的样品啥都没有，郁闷啊！！！图片中阳性对照跑出来两个条带，一条亮的是我的目的条带，目的条带是592bp，弱的不知道是什么。。。


[ Last edited by 襄阳蓉儿 on 2012-7-16 at 20:30 ]
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1楼 2012-07-15 15:39:09
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jqzhu1998

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-15 19:46:10
是不是写错了？？12.5ul的酶？？
第二步的体系可以放大，做75或100
慢慢来，多看看师兄做的，自己再多琢磨琢磨，细心一点，肯定能做出来的。
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2楼2012-07-15 16:24:17
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我以前也做过巢式PCR，一般很容易出结果的，你肯定是中间出了问题，我建议，你第一步先跑胶看一下，如果第1步啥都没有，那第2步就不好说
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3楼2012-07-16 08:43:51
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jl860822

金虫 (正式写手)
妹子长的不错嘛
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4楼2012-07-16 08:44:54
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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-16 08:43:51
我以前也做过巢式PCR，一般很容易出结果的，你肯定是中间出了问题，我建议，你第一步先跑胶看一下，如果第1步啥都没有，那第2步就不好说

我问了师兄也自己查了相关资料，第一步没有条带是正常的吧？
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5楼2012-07-16 09:15:37
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倾听世界0721

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
第二次可以做到50ul，把引物、dNTP的量增加一倍。
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6楼2012-07-16 10:20:10
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chan_6217911

金虫 (小有名气)
★
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有可能是第二步PCR的模板量（你用的是2ul）太多了，你可以用0.5ul或者稀释一定倍数。
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7楼2012-07-16 12:10:33
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xudabin98

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
额滴神啊,你是用的什么酶啊?要用那么大的量,P不出来应该是正常的.第一步PCR结果电泳也看不出啥来.你对招标准PROTOCOL多看看.
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8楼2012-07-16 12:39:36
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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xudabin98 at 2012-07-16 12:39:36
额滴神啊,你是用的什么酶啊?要用那么大的量,P不出来应该是正常的.第一步PCR结果电泳也看不出啥来.你对招标准PROTOCOL多看看.

说错了，那个是Premix
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9楼2012-07-16 15:41:53
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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)
襄阳蓉儿: 回帖置顶 2012-07-16 20:14:55
阳性对照跑出来两个条带，一条亮的是我的目的条带，弱的不知道是什么。。。啥玩意儿啊
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10楼2012-07-16 20:13:53
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 襄阳蓉儿 at 2012-07-16 09:15:37
我问了师兄也自己查了相关资料，第一步没有条带是正常的吧？...

我觉得不太正常，以前我做的时候，第1次一般都会有些弥散带，所以我觉得你第1轮是不是就没扩增好，或者你第1轮的PCR降低一下退火温度，第2轮再提高一下退火温度试试
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11楼2012-07-16 21:28:23
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-16 08:43:51
我以前也做过巢式PCR，一般很容易出结果的，你肯定是中间出了问题，我建议，你第一步先跑胶看一下，如果第1步啥都没有，那第2步就不好说

您好，我做巢式PCR做了一周多了，用特异性引物和此模板可以扩增出来，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？
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12楼2013-05-16 21:56:35
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by xudabin98 at 2012-07-16 12:39:36
额滴神啊,你是用的什么酶啊?要用那么大的量,P不出来应该是正常的.第一步PCR结果电泳也看不出啥来.你对招标准PROTOCOL多看看.

您好，我做巢式PCR做了一周多了，用特异性引物和此模板可以扩增出来，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？
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13楼2013-05-16 22:04:44
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-16 21:28:23
我觉得不太正常，以前我做的时候，第1次一般都会有些弥散带，所以我觉得你第1轮是不是就没扩增好，或者你第1轮的PCR降低一下退火温度，第2轮再提高一下退火温度试试...

您好，我做巢式PCR做了一周多了，用特异性引物和此模板可以扩增出来，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？
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14楼2013-05-16 22:06:03
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