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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)


[交流] 求助,巢式PCR,出了点儿问题,!

第一步pcr都是25微升的体系,12.5微升的premix,上下游引物都是0.5微升,模版是2微升。。。
第二步50微升体系premix,上下游引物1微升,模版2微升
哪里出问题了,难道是我的操作?
师兄做的p出来的条带很亮很好,应该不是引物设计问题吧。
为什么我做的阳性对照有条带而且非常的弱,我的样品啥都没有,郁闷啊!!!图片中阳性对照跑出来两个条带,一条亮的是我的目的条带,目的条带是592bp,弱的不知道是什么。。。


[ Last edited by 襄阳蓉儿 on 2012-7-16 at 20:30 ]
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chan_6217911

金虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
有可能是第二步PCR的模板量(你用的是2ul)太多了,你可以用0.5ul或者稀释一定倍数。
7楼2012-07-16 12:10:33
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jqzhu1998

铁虫 (小有名气)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-15 19:46:10
是不是写错了??12.5ul的酶??
第二步的体系可以放大,做75或100
慢慢来,多看看师兄做的,自己再多琢磨琢磨,细心一点,肯定能做出来的。
2楼2012-07-15 16:24:17
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jl860822

金虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我以前也做过巢式PCR,一般很容易出结果的,你肯定是中间出了问题,我建议,你第一步先跑胶看一下,如果第1步啥都没有,那第2步就不好说
3楼2012-07-16 08:43:51
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襄阳蓉儿

新虫 (小有名气)


引用回帖:
3楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-16 08:43:51
我以前也做过巢式PCR,一般很容易出结果的,你肯定是中间出了问题,我建议,你第一步先跑胶看一下,如果第1步啥都没有,那第2步就不好说

我问了师兄也自己查了相关资料,第一步没有条带是正常的吧?
5楼2012-07-16 09:15:37
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