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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET-28a原核不能表达目的蛋白
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lx19880717

金虫 (初入文坛)

[求助] pET-28a原核不能表达目的蛋白 已有2人参与

我在做原核表达的过程中，使用了pET-28a载体，Rosetta（DE3）表达菌株，但是37℃诱导表达后，连包涵体都没有看到，基本没有任何的蛋白表达，所以想请问一下大家，能不能帮我分析一下是什么原因？谢谢。
PS：我的目的蛋白大量重复序列，是否是由于重复序列导致蛋白在表达过程中无法折叠，如果是这个原因有什么办法可以解决，谢谢。
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1楼 2012-03-11 22:08:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2012-03-14 22:15:48
我跟你一样，也是用的PET28a，不过我用的菌是BL21。
1.你先到上游看看，是不是载体构建的问题；菌p，提质粒酶切，测序看看。
2.上游没问题的话，改变诱导条件试试，T7lac启动子用IPTG1mM诱导6小时看看；
3你的菌有没有问题，可以把构建的重组载体提出来转化到新的感受态试试，我的问题就是这么解决滴
4.换高浓度胶跑跑看看，高浓度提高分辨率。
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无善无恶心之体
4楼2012-03-14 17:49:04
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普通回帖

wszhyd

金虫 (初入文坛)
我也遇到楼主一样的问题，选用位点是Nco1 和Xho1 ，也是不表达，帮顶一下，希望高人指点一下。
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2楼2012-03-12 16:58:46
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lx19880717

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by wszhyd at 2012-03-12 16:58:46:
我也遇到楼主一样的问题，选用位点是Nco1 和Xho1 ，也是不表达，帮顶一下，希望高人指点一下。

呵呵，谢谢！
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3楼2012-03-12 20:33:16
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螺旋技术

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励 2012-03-14 22:15:57
先分析是否含有大量的稀有密码子，如果没有，应该能表达。

如果稀有密码子太多，这个问题就很难办了，方法有2:换含有稀有密码子的表达宿主；二：对基因进行密码子优化，在表达。
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5楼2012-03-14 20:00:21
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pwj

银虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励下 2012-03-14 22:16:09
试试TB培养基，以前我也遇到同样问题，换了TB培养基就好了！希望你能成功
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6楼2012-03-14 21:50:12
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 螺旋技术 at 2012-03-14 20:00:21:
先分析是否含有大量的稀有密码子，如果没有，应该能表达。

如果稀有密码子太多，这个问题就很难办了，方法有2:换含有稀有密码子的表达宿主；二：对基因进行密码子优化，在表达。

请问哪个软件或网站能分析稀有密码子？烦请告知一下哈，谢谢。
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Things change, people grow.
7楼2012-04-06 12:24:56
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yanfeier

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-04-06 12:24:56:
请问哪个软件或网站能分析稀有密码子？烦请告知一下哈，谢谢。

http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html 在线直接就可以分析
如果是稀有密码子的问题  若不是特别严重可以通过选择合适的宿主菌解决的。再有就是你关注一下你的酶切位点，是否导致你的目的片段的读码框是否发生移位。你也可以考虑你的诱导剂加入的浓度，但是一般的情况下不会是主要的原因。
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8楼2012-04-06 15:12:09
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yanfeier at 2012-04-06 15:12:09:
http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html 在线直接就可以分析
如果是稀有密码子的问题  若不是特别严重可以通过选择合适的宿主菌解决的。再有就是你关注一下你的酶切位点，是否导致你的目的片段的读码框是否发生 ...

嗯非常感谢。
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Things change, people grow.
9楼2012-04-07 08:39:30
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的是BL21这个菌株，诱导包涵体蛋白可以使用低温18℃左右
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10楼2012-04-10 10:04:48
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